根据Wang等人的前期工作（报道季铵盐-QAS与NaCl相比能更好地实现空衣壳和实衣壳的分离），BIA实验室将四甲基氯化铵（TMAC）和氯化胆碱与NaCl一起进行测试。此外BIA实验室也测试了上述所有盐在添加MgCl₂后的色谱性能（Mihevec et. Al, 2023）。

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实验设计

将先前通过阳离子交换色谱（CIMmultus^TM SO3）捕获的AAV2/8血清型样品在缓冲液A中稀释，上样至CIMac^TM AAV empty/full -0.1分析柱（3.66E + 11 vg/CV）。

PATfix系统（BIA Separations）用于色谱分析。

检测器设置

• 电导率和pH值

• 吸光度（260nm，280nm），50 mm UV流通池

• 荧光（激发/发射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

流动相

缓冲液A：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

缓冲液B：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 400 mM NaCl + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 450 mM TMAC + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂ + 400 mM 氯化胆碱 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

缓冲液C：1 M NaOH + 2 M NaCl

缓冲液D：1 M 乙酸铵

方法

用100 柱体积（CV）缓冲液B（洗脱液）进行从0%至100%的梯度洗脱。按照指导手册的方法进行柱平衡和原位清洗（CIP）（使用缓冲液A进行2分钟柱平衡，再用缓冲液C用于原位清洗1分钟，之后使用缓冲液D清洗去除NaOH。最后使用缓冲液A使电导率和pH值恢复到缓冲液基线水平）。

根据标准方程? = 2 ?_F − ?_E / ?_F + ?_E，基于荧光计算峰间分离度:，其中 t_F和 t_E是保留时间，w_F 和 w_E 是AAV实衣壳和空衣壳基线处的峰宽。根据荧光信号也计算了AAV空衣壳和实衣壳的百分比（% E和% F），一些色谱图中也对UV和光散射进行了比较。

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结果

筛选不同的洗脱盐：

在不添加2 mM MgCl₂情况下，使用三种不同配方的缓冲液B：每个色谱图显示2至3个重叠峰?？找驴窃诘谝桓龊偷谌龇逯邢赐逊掷耄ㄊ褂肨MAC和氯化胆碱的缓冲液，第三个峰未分离），实衣壳在第二个峰中洗脱。使用季铵盐观察到更高的AAV空/实衣壳分离度，但第三个未分离的峰看起来像实衣壳峰的延长拖尾。

 在添加2 mM MgCl₂情况下，使用三种不同配方的缓冲液B：每个色谱图显示两个重叠的峰。第一个峰为空衣壳，第二个峰为实衣壳。向缓冲液中添加镁会导致分离度降低，并使所有洗脱盐的洗脱曲线更统一。然而，空衣壳峰的响应增加并且峰变窄。
 

 色谱峰积分示例，主馏分显示在相应的色谱峰中。生成以下色谱图时未添加镁：

 所有测试盐（紫外、荧光和光散射信号）在有或无 MgCl2 的情况下的色谱叠加图：

使用NaCl作为洗脱盐，有MgCl₂（实线）/无MgCl₂（虚线）的色谱叠加图。

不添加Mg可见三个分离峰。
 

 使用TMAC作为洗脱盐，有MgCl₂（实线）/无MgCl₂（虚线）的色谱叠加图。

如果不添加MgCl₂，则无法分离第三个峰。洗脱电导率更高（对使用NaCl梯度以低电导率洗脱的血清型可能有用）。
 

 使用氯化胆碱作为洗脱盐，有MgCl₂（实线）/无MgCl₂（虚线）的色谱图叠加。

如果不添加MgCl₂，则无法分离第三个峰。与TMAC相比曲线相似，但洗脱电导率更低。
 

 实验结果总结

基于荧光信号的AAV实衣壳的

分辨率和百分比
 

 要点：

向缓冲液中添加镁会降低分离度，但会改善所有洗脱盐的洗脱曲线。这意味着只有两个峰被分离，左峰是空衣壳AAV，右峰是实衣壳AAV。尽管NaCl分辨率较低，但有氯化镁时，如果在两峰之间的最低信号处画垂直线到X轴用作区分空AAV衣壳和实AAV衣壳，则能显示出与无氯化镁时相似的实衣壳百分比（详见上图示例）。

与NaCl相反，季铵盐（TMAC，氯化胆碱）在无氯化镁时导致更宽的峰，更高的空/实衣壳分离度，并且第三个空衣壳峰洗脱于峰尾并没有与实衣壳峰分离。然而，添加 MgCl₂时季铵盐显示出比NaCl更好的分离度。其中一个可能的原因是它们作为去离液盐，可以稳定空病毒衣壳和实病毒衣壳之间的疏水作用。

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