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免疫熒光 (IF)介紹

閱讀:1794      發(fā)布時間:2023-12-21
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免疫熒光是一種免疫染色技術,可使用熒光顯微鏡觀察樣品中的抗原。使用有機溶劑和化學交聯(lián)劑仔細固定樣品,以保持其細胞完整性以及亞細胞結構。然后對它們進行透化以進行免疫染色,然后進行封閉以盡量減少非特異性結合。然后用抗體對樣品進行免疫染色,并通過熒光反應使目標顏色可視化。


材料

  • 10X PBS:要制備 1L,將 80g NaCl、2g KCl、2g KH2PO4 和 28.5g NaHPO4 添加到 1L 注射用水中。將 pH 值調整至 7.4。

  • 4% 聚甲醛:要制備 100mL,將 4g 聚甲醛添加到 100mL 1×PBS 中。將 pH 值調整至 7.4。

  • 1×PBS/0.2% Triton X-100(PBS/Triton):要制備 500mL,將 1mL Triton X-100 添加到 500mL 1× PBS 中。

  • 1×PBS/3% BSA(PBS/BSA):配制100mL時,將3g BSA加入到100mL 1×PBS中。

協(xié)議

    準備 固定 透化

  1. 在 PBS 中短暫沖洗細胞。

  2. 吸出PBS,用4%聚甲醛覆蓋細胞至2-3mm深度約200ul。

  3. 讓細胞在室溫下固定 15 分鐘。

  4. 吸出固定液,用 PBS 沖洗 3 次,每次 5 分鐘。

  5. 吸出PBS,用PBS/Triton在室溫下將細胞覆蓋至2-3mm深度約200ul 5分鐘。

  6. 吸出滲透劑在 PBS 中沖洗 3 次,每次 5 分鐘。

免疫染色

  1. 將 200ul 用 PBS/BSA 稀釋的一抗輕輕添加到 24 孔板的每孔中。

  2. 37℃ 孵育 60 分鐘或 4℃ 過夜。

  3. 吸出稀釋的一抗,然后在 PBS 中沖洗 3 次,每次 5 分鐘。

  4. 將用 PBS/BSA 稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗加入到 24 孔板中,每孔 100ul,室溫避光孵育 30 分鐘。

  5. 吸出稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗,然后在 PBS 中沖洗 3 次,每次 5 分鐘。

  6. 在熒光顯微鏡下測試。




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