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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）技術(shù)循環(huán)檢測方法
閱讀：94 發(fā)布時間：2025-7-15聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。其核心原理是模擬生物體內(nèi)的DNA復(fù)制過程，通過特定的引物、DNA聚合酶和dNTPs（脫氧核糖核苷酸）來實現(xiàn)目標(biāo)DNA序列的指數(shù)級擴增。
PCR技術(shù)的實現(xiàn)依賴于三個關(guān)鍵步驟的循環(huán)進行：
一、變性（Denaturation）：在高溫（通常90-96℃）下，雙鏈DNA模板中的氫鍵斷裂，導(dǎo)致雙鏈分開為兩條單鏈。這是擴增過程中的第一步，也是將模板DNA變成單鏈狀態(tài)的過程。
二、退火（Annealing）：溫度降低（通常50-65℃）后，引物與單鏈DNA模板上互補的序列結(jié)合。引物是短的DNA序列，設(shè)計用于與目標(biāo)DNA片段的兩端特定區(qū)域互補，從而引導(dǎo)后續(xù)的合成過程
三、延伸（Extension）：在中溫（通常72℃左右）下，Taq DNA聚合酶（一種耐熱DNA聚合酶）作用于引物-模板復(fù)合物，沿著模板DNA合成新的互補鏈。這個過程中，dNTPs被聚合到引物的3'端，形成新的DNA鏈，直至達(dá)到模板的末端。
這三個步驟組成一個循環(huán)，每完成一個循環(huán)，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量理論上增加一倍。通過25-35個循環(huán)，可以將目標(biāo)DNA序列擴增至數(shù)百萬倍，從而達(dá)到可以檢測的水平。
PCR技術(shù)的檢測方法主要依賴于擴增產(chǎn)物的檢測，傳統(tǒng)的PCR通常通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測產(chǎn)物。隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了實時熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（Digital PCR, dPCR）等更為先進的檢測方法。
一、傳統(tǒng)PCR檢測：
瓊脂糖凝膠電泳：擴增后的DNA片段通過電泳分離，根據(jù)其大小在凝膠上形成條帶，通過觀察條帶的出現(xiàn)與否來判斷擴增是否成功。
二、實時熒光定量PCR（qPCR）：
熒光染料法：使用SYBR Green I等染料，其能嵌入雙鏈DNA中并在熒光下發(fā)光，隨著PCR循環(huán)的進行，熒光信號逐漸增強，通過檢測熒光強度來定量目標(biāo)DNA。
探針法：采用TaqMan探針等熒光標(biāo)記探針，探針與目標(biāo)序列結(jié)合后被DNA聚合酶酶切，報告基團與淬滅基團分離，釋放熒光信號，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化來定量目標(biāo)DNA。
三、數(shù)字PCR（dPCR）：
油包水液滴式數(shù)字PCR（ddPCR）：將樣本分成數(shù)萬個獨立的微滴（液滴），每個微滴中包含少量的DNA模板。通過PCR擴增后，檢測每個微滴中的熒光信號，陽性信號表示微滴中含有目標(biāo)DNA，陰性信號則表示沒有。通過泊松分布計算，最終獲得目標(biāo)DNA的絕對定量結(jié)果。
數(shù)字PCR技術(shù)由于其不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線、操作簡單、靈敏度高（±10% copies/μL）和適合低豐度目標(biāo)檢測等優(yōu)勢，已成為一種非常有潛力的核酸定量技術(shù)。與傳統(tǒng)qPCR相比，它在低拷貝數(shù)目標(biāo)檢測、拷貝數(shù)變異分析、稀有突變檢測等領(lǐng)域展現(xiàn)出有的優(yōu)勢。