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單克隆抗體 N-糖基化的毛細(xì)管電泳和質(zhì) 譜分析
閱讀：114 發(fā)布時(shí)間：2025-5-13前言近年來(lái)，單克隆抗體 (mAb) 已成為生物制藥行業(yè)具有潛力的新興蛋白候選藥物。其藥物研發(fā)流程包括一系列精細(xì)的控制和評(píng)估步驟，需要仔細(xì)、嚴(yán)格地監(jiān)測(cè)目標(biāo)化合物的治療穩(wěn)定性及有效性。因此，在商業(yè)化前的每個(gè)階段對(duì) mAb 進(jìn)行全面表征是極其有益的。在大量研究成熟的蛋白翻譯后修飾中，已知糖基化在很多生物過(guò)程中都扮演著重要的角色（例如蛋白降解和轉(zhuǎn)錄），從而影響健康和疾病進(jìn)展1。而鑒定重要蛋白分子中連接的糖基則需要一種可靠、穩(wěn)定、靈敏的分析技術(shù)。近來(lái)，毛細(xì)管電泳 (CE) 在糖蛋白分析領(lǐng)域得到了眾多關(guān)注，主要是由于其可以縮短分析時(shí)間，并保持高效分離。使用一種熒光發(fā)色團(tuán)（ATPS，陰離子）對(duì)酶解所得多糖進(jìn)行標(biāo)記，CE 分離后，利用高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光 (LIF) 或質(zhì)譜 (MS)進(jìn)行檢測(cè)。APTS 標(biāo)記將負(fù)電荷傳遞給多糖，可提高電泳分離能力，并使之更適用于電噴霧電離（負(fù)模式），使整個(gè)分離和檢測(cè)過(guò)程與熒光標(biāo)記化學(xué)高度兼容。將CE 與 MS 串聯(lián)有益于鑒定未知的糖基化修飾或質(zhì)量信息，并進(jìn)行峰指認(rèn)2。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了利用 CE-QTOF MS 對(duì)重組 mAb 所得的 N-糖基進(jìn)行分析。APTS 標(biāo)記的 CE-MS 方法有助于鑒定 mAb 上的所有糖基。此外，還可得到每種多糖的相對(duì)百分比，以表征主要及次要糖基化修飾。
前言近年來(lái)，單克隆抗體 (mAb) 已成為生物制藥行業(yè)具有潛力的新興蛋白候選藥物。其藥物研發(fā)流程包括一系列精細(xì)的控制和評(píng)估步驟，需要仔細(xì)、嚴(yán)格地監(jiān)測(cè)目標(biāo)化合物的治療穩(wěn)定性及有效性。因此，在商業(yè)化前的每個(gè)階段對(duì) mAb 進(jìn)行全面表征是極其有益的。在大量研究成熟的蛋白翻譯后修飾中，已知糖基化在很多生物過(guò)程中都扮演著重要的角色（例如蛋白降解和轉(zhuǎn)錄），從而影響健康和疾病進(jìn)展1。而鑒定重要蛋白分子中連接的糖基則需要一種可靠、穩(wěn)定、靈敏的分析技術(shù)。近來(lái)，毛細(xì)管電泳 (CE) 在糖蛋白分析領(lǐng)域得到了眾多關(guān)注，主要是由于其可以縮短分析時(shí)間，并保持高效分離。使用一種熒光發(fā)色團(tuán)（ATPS，陰離子）對(duì)酶解所得多糖進(jìn)行標(biāo)記，CE 分離后，利用高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光 (LIF) 或質(zhì)譜 (MS)進(jìn)行檢測(cè)。APTS 標(biāo)記將負(fù)電荷傳遞給多糖，可提高電泳分離能力，并使之更適用于電噴霧電離（負(fù)模式），使整個(gè)分離和檢測(cè)過(guò)程與熒光標(biāo)記化學(xué)高度兼容。將CE 與 MS 串聯(lián)有益于鑒定未知的糖基化修飾或質(zhì)量信息，并進(jìn)行峰指認(rèn)2。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了利用 CE-QTOF MS 對(duì)重組 mAb 所得的 N-糖基進(jìn)行分析。APTS 標(biāo)記的 CE-MS 方法有助于鑒定 mAb 上的所有糖基。此外，還可得到每種多糖的相對(duì)百分比，以表征主要及次要糖基化修飾。
CE-MS 儀器方法CE-ESI-MS 分析中使用 7100 CE 系統(tǒng)（配有CE-MS毛細(xì)管卡套，部件號(hào) G1603A），串聯(lián) 6520 精確質(zhì)量 Q-TOF（配有雙離子源及正交共軸鞘液接口，部件號(hào) G1607B）3。使用空緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化分離條件和噴霧穩(wěn)定性。鞘液 CE-MS 接口處維持一個(gè)較低的流速 (5 µL/min) 以保持 CE 分離的高效性，并為電噴霧電離提供一個(gè)穩(wěn)定流及其它必要的噴霧條件。Q-TOF 參數(shù)由MS 調(diào)諧系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化，并利用 ESI 調(diào)諧混合物對(duì) MS 系統(tǒng)進(jìn)行校正。
表 1 列出了 CE-MS 的參數(shù)。所有化合物列表由 MassHunter 分子特征提取 (MFE)算法提取所得。
結(jié)果與討論盡管 CE-LIF 常用于多糖分析，但 CE-MS能提供分子量信息，所以在鑒定電泳結(jié)果中的未知遷移條帶方面具有優(yōu)勢(shì)。在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，將 CE 與配有鞘液接口的 Q-TOF MS 串聯(lián)，以指認(rèn) mAb 所得多糖的質(zhì)量信息。方案 1 描述了 mAb 糖譜的 CE-MS 分析步驟。簡(jiǎn)單地說(shuō)，抗體釋放的多糖先進(jìn)行 APTS 標(biāo)記，然后進(jìn)行 CE-MS 分析。圖 1 為重組 mAb 中釋放所得的 N-糖基的 CE-MS 總化合物譜。利用 PVA 涂層毛細(xì)管，所有 mAb 多糖均可在 15 分鐘分離時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)遷移。通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們成功鑒定了未帶電荷的N-糖基類(lèi)化合物，包括 G0、G0F、G1、G1F、G2 和 G2F。此外，還觀(guān)察到了單唾液酸化的多糖 G2F+1NANA。所有峰的指認(rèn)均基于 Q-TOF 分析測(cè)得的精確分子量。
表 2 總結(jié)了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類(lèi)，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數(shù)據(jù)未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優(yōu)勢(shì)（即 CE-MS 的互補(bǔ)價(jià)值）。
表 2 總結(jié)了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類(lèi)，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數(shù)據(jù)未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優(yōu)勢(shì)（即 CE-MS 的互補(bǔ)價(jià)值）。
表 2 總結(jié)了本研究中鑒定的多糖。需要注意的是，在 CE-MS 分析中成功鑒定出 G2類(lèi)，但 LC/MS 分析中并未鑒定出（數(shù)據(jù)未列出），表明基于 CE-MS 的分析有顯著優(yōu)勢(shì)（即 CE-MS 的互補(bǔ)價(jià)值）。
很敏感。通過(guò)計(jì)算相對(duì)于總化合物峰容量的百分容量，可對(duì) mAb 釋放所得的多糖進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果如表 2 所示。在本例中，G2+1NANA 是糖型中的主要形式。
這些結(jié)果清晰地指出 CE-MS 可成為檢測(cè)糖譜的一種有效的替代分析工具。串聯(lián)CE-MS 分離可避免污染，這是因?yàn)闃悠诽幚聿襟E很少，CE 分離使用的緩沖液與電噴霧電離高度兼容。與 CE-LIF 相比，該方法在糖譜分析中更為靈敏、精確。
結(jié)論本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)提供了一個(gè)基于 Agilent CE-MS的 mAb糖譜分析方法。Agilent MassHunter和 BioConfirm 軟件包的強(qiáng)大數(shù)據(jù)處理能力能夠成功、詳盡地鑒定并得出 mAb 糖型譜。此外，通過(guò)分離主要和次要多糖形式，可合理解析糖基化模式。