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近期，我们介绍了 Leica SP8 FALCON 的一些应用案例，它能实时测量分子间的相互作用 (FLIM-FRET)，实时测量钙浓度变化，实时测量荧光分子的代谢 (如癌变引起的 NADH 的寿命变化) 或者所处微环境的变化 (如 pH)，能对光谱相近的不同染料或自发荧光和染料进行拆分，还能与共聚焦的多种采图模式 (如智能化大图拼接、光谱扫描、时间序列、三维层切) 和技术 (如 DIVE 多光子成像、STED 纳米分辨率成像) 相结合。总之， FALCON 是荧光功能成像的极jia工具。

那么今天咱们就讲讲 FALCON 的使用技巧，帮助大家更好地理解这个新技术。

荧光寿命测量步骤

SP8 FALCON 的荧光寿命成像 (FLIM) 功能内置在共聚焦操作软件 LAS X 里，只需点击 FLIM 即可激活 (见下图)。

接下来，我们只需三步就可以完成荧光寿命测量。本文中所用样品为雏菊 (Bellis Perennis) 花蕾。

1. 预览及调节参数

点击预览，系统同时显示荧光强度图、平均荧光寿命图和平均荧光寿命曲线，并以光子数直方图中的红线来提示光子数的理想上限 (见下图)，便于我们调节激光强度获得理想的光子数 (以接近但不超过红线为宜)。

2. 设置条件并采图

在采集时间、采集帧数及大光子数三者中选择设置一项即可 (见下图)，如果需要采集时间序列或者三维，按常规共聚焦采集模式设置总时长或层切起点/终点即可。然后点击 start 进行采图。

3. 数据分析

选择寿命成分数量 (见下图一棕色箭头)，点击 Fit (图一红色箭头)，系统即自动进行曲线拟合。寿命成分数量可从 1 开始，直至获得满意的拟合曲线 (见图三)。同时，系统根据拟合结果显示荧光寿命图 （见图二）。

到这里，图像和数据的采集及分析就完成了，点击保存图像和结果即可。

一键采图，一键拟合，so easy！

寿命成分拆分图像

当然，我们还可以根据拟合出的寿命成分对图像进行拆分，以上述分析结果为例，点击 FLIM Image Fit，系统自动按照拟合出的三种寿命进行拆分，得到以下图像。这特别适合于拆分光谱接近的不同染料或者染料和自发荧光。以后遇到多色荧光成像，再也不用担心串色和分不开了。

对厚样品，FALCON 还可以直接采集和显示三维的荧光寿命图像 (见下图)，要做成视频也*没有问题，用 LAS X 的 3D 重建?？榫涂梢?。

SP8 FALCON 的功能还远不止于此，它还能进行任意感兴趣区域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析，和 DIVE、STED 结合成像，以及近期刚刚增加的 Phasor 功能，为传统的荧光成像增加维度、拓宽思路。有兴趣的话，且听下回分解。