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2-8℃避光

1.MMP-13 底物短期 4℃避光保存，长期-20℃避光保存:。 2.MMP-13 底物在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要 加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离 心至管底部再打开螺旋盖。 3.可以用手捂住使其融解或 37℃短时间水浴， 4.有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期。 5.试剂拆封后请尽快使用完。

一年

荧光酶标仪/荧光光度计

细胞/组织

1.荧光酶标仪/荧光光度计； 2.离心机； 3.移液器； 4.冰箱； 5.冰盒；

1.PBS; 2.蛋白定量试剂盒

1.离心管； 2.吸头； 3.一次性手套； 4.荧光检测专用的黑色96孔板

1.37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。 2.如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到 200-500 ug每样。 3.如果样品中激活的MMP水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个 MMP 激活比较强的时间点进行检测。 4.MMP-13 底物避光保存，使用过程中尽量避光。 5.底物为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需 要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。 6.使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使 DMSO 溶液集中于管底。 7.酶标仪检测必须使用荧光检测专用的黑色 96 孔板。

一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制 根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入 10 ul DTT 充分混匀置冰上备用。 二、样品处理 A.细胞样品 1.收集 5x10（6次方）个细胞，在 4℃，500xg 条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可 能吸干，收集细胞。 2.用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3.在细胞中加入 50 ul冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15 秒。 4.置冰上持续振荡 20-45 分钟。 5.在 4℃，12000xg 条件下离心 15 分钟。 6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用 B组织样品 1.取适量组织样本剪碎，按照每 50 mg/100 ul冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀 浆至无明显肉眼可见固体，冰上振荡 20-45 分钟，小心将上清吸入另一预冷的 干净离心管。 2. 在 4℃，12000xg条件下离心5分钟。 3.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用 三、对上述处理过的上清进行蛋白定量。 【注】: 1.必须进行蛋白定量，以保证后续步骤的蛋白上样量足够，否则容易出现检测不到结果的 情况。 2.用 BCA 蛋白定量试剂盒进行定量的话，裂解液中不要加入 DTT。 四、MMP1活性检测 1.取 50ul 裂解上清(含 100-200 ug 蛋白)，加入 45ul 检测缓冲液。 2.再加入 5 ul MMP-8 荧光底物，充分混匀，在 37℃下避光反应 1-2 小时。 3.荧光酶标仪检测荧光强度。Ex=325 nm，Em=400 nm。 4.根据凋亡的细胞的荧光值与对照细胞样本的荧光值的比值计算相对的MMP1 活性程度变化。

荧光强度值偏低 1.样品上样量不够:本方法检测需要的细胞数量须在3x10（6次方）以上，或者新鲜组织 50 mg 以上，每次反应的蛋白量需要在 100 μg 以上。如果量不够，请增加细 胞或组织的量。 2.样本不新鲜:使用新鲜的细胞或组织样本。 3.样品裂解不够充分:细胞或组织需要进行充分裂解，可以加入适当的蛋 白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。 4.样品中激活的 MMP-8 水平偏低:首先确认模型的凋亡现象是否明显，以及根 据文献和其他验证方法确认该凋亡是否激活 MMP-8。 5.检测时间点的选择是否合适:不论哪种通路的凋亡，需要在MMP-8被有效激 活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。 6.不适合本方法检测:某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能是非依赖于 MMP-8活化 的机制，此种情况时利用本试剂盒检测 MMP-8无明显变化，需要考虑凋亡机 制的其他通路。