2-8℃ 避光

1.探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2.探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

荧光分光光度计或荧光酶标仪

植物组织

1.使用方便：可用荧光酶标仪、荧光分光光度计检测；
2.背景低，灵敏度高；
3.线性范围宽，使用方便。

1.荧光分光光度计或荧光酶标仪
2.匀浆机/匀浆器
3.离心机
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.纯水
3.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.荧光探针为DMSO溶液，冬季气温较低时在室内时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
3.使用前，先将本品取出回温至室温（20℃以上），并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

试剂准备：
根据样本数量，用纯水将O66探针10倍稀释。充分混匀，备用。
【注】：
?不可以一次性将探针全部稀释。
?现配现用。
?O66探针液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
?微量操作时，注意探针要有效加入匀浆液，避免没有加入。
?以下步骤使用的O66探针为此步骤稀释过的探针。

样本处理：
1.刚取得的新鲜植物组织样本用PBS洗净。
2.准确称取50 mg或100 mg植物组织样本，加入500 μl-1 ml匀浆缓冲液A，用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
3.在100×g，4℃离心5分钟，取上清备用。

样本检测：
1.在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升O66探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
【注】：
?不同样本的活性氧差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量。一般加入2-10 μl探针，染色终浓度按试剂盒中探针母液的200-1000倍稀释，200倍稀释适合大多数样本。
?如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以减少探针用量。保证所有样本探针用量一致即可。
?以酶标仪检测为例。也可以用荧光分光光度计检测，根据所使用仪器决定匀浆液体积和染色容器。
2.在37℃避光孵育20-30分钟。
3.置于酶标仪中，后于激发波长为506 nm、发射波长526 nm检测荧光强度。
【注】：
?或使用荧光光度计等其它荧光检测设备。
?必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
?如果荧光强度太强，超过了仪器的检测范围，可以将孵育后的匀浆上清液稀释后再检测。一般稀释5-50倍。

蛋白定量：
1.另取50微升上清匀浆液，用PBS大约稀释30倍。
2.取100微升进行蛋白定量。

结果处理：
以荧光强度（RFU）/ 蛋白浓度（毫克蛋白）表示植物组织单线态氧强度。
【注】:
?数据与蛋白浓度的单位无关。
?此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化处理。
?荧光强度强则单线态氧（1O2）含量高。
?可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较单线态氧（1O2）程度差异。