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实时荧光定量PCR 引物二聚体相关问题解答
阅读：440 发布时间：2024-8-5 聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能强大的技术之一。实时荧光定量PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成，常用于定量样本中的 DNA 或RNA。
利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料，采用实时荧光定量PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。利用序列特异性引物，可测定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷贝数。通过检测 PCR 循环的每个阶段中扩增产物的量，实现定量。如果样本中存在高丰度的特定序列 (DNA 或 RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。
实时荧光定量 PCR 分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果，常见引物二聚体相关问题分析如下：
1、引物二聚体形成的原因
引物二聚体的形成是在实时荧光定量 PCR 设计和验证过程中最常见的问题之一，当引物对之间的部分序列存在同源性时，可形成引物二聚体。如果在 PCR 反应过程中引物退火形成二聚体，则 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚体，形成长于原始引物的产物，它可导致循环过程中更易出现退火错误。根据长度的不同，引物也可能出现自身折叠，由此与模板形成冲突。反应的复杂性 (尤其在多重反应过程中) 可使上述不良影响发生的几率增加。
2、如何确定是否存在引物二聚体？
凝胶电泳是显示引物二聚体的一种合适的方法。如图 1所示，引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位100 bp 以下。在 PCR 过程中，二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。引物二聚体通常随模板的减少而增加。单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于，其灵敏度低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。凝胶电泳分析的优势是当解离曲线 (熔解曲线) 数据同时可用时，产物的大小有助于对结果进行综合解释。
图1
解离曲线，又称熔解曲线，是利用双链 DNA 结合染料获得的标准反应热廊线。如果扩增具有好的特异性，则实时荧光定量 PCR 板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽的“波形"，显示其在 70°C 左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。若对解离曲线中是否存在引物二聚体有任何疑问，可将观察的结果与 NTC（No Template Control，即无模板对照，是阴性对照）反应孔相比较，当模板不存在时，更易出现引物二聚体峰 (图 2，熔解曲线中突出显示了特异性扩增 (图2A) 和引物二聚体效应(图2B)?？衫?NTC 样本在熔解曲线中产生多余的峰(图2B) 识别出引物二聚体)。
3、如何减少或去除引物二聚体？
如果出现了引物二聚体，有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。
（1） 首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。大多数情况下，两步循环 (由 95°C 变性步骤直接进入60°C 退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60°C。
（2）可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为 200 nM，但如有需要，可将浓度降至 60 nM。
（3）镁的最佳浓度一般约为 3 mM。高于此浓度易形成引物二聚体。
（4）如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计 (如有需要)。通常情况下，最好使用热启动 DNA 聚合酶，并在冰上进行反应。
（5）在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。