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1、如何确定引物的浓度？

前面我们说到，引物一般交由试剂公司合成，有时候具体的浓度我们也不能确定。有些人喜欢稀释十倍，有些人喜欢稀释二十倍。我个人认为比较稳妥的做法是在每次拿到反转的 cDNA 后，先会稀释 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循环数一般为 25 循环，鉴定一下具体浓度，再决定最后的稀释倍数。

2、合成的引物是我们想要的引物吗？

一般来说在拿到很多引物的时候，可以通过普通的 PCR 看看是否是单一条带，鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱，则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。

3、操作过程中需要注意哪些问题？

一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情说三遍。根据经验，少量模板的加入，容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差，我们一般会将样本再稀释一倍，加样的时候多加一倍，减少 H2O  的加入量。

4、你确定你的 PCR 板和仪器配套吗？

你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器，那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。这种状况实验小白尤其需要注意。

5、凝胶放入电泳槽有什么注意事项吗？

凝胶放入电泳槽时一定要注意方向，核酸是带负电的，所以电泳的方向是从负极向正极跑，因此，加样孔一定要对着负极放置，不然样本就跑到胶外面去了。