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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR)原理及熒光技術(shù)方法
閱讀：802 發(fā)布時間：2024-10-14實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應用。
RT-qPCR原理的三個主要步驟：
1 、反轉(zhuǎn)錄：
1）、使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
2）、該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。
3）、反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。
2 、PCR擴增：
1）、使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環(huán)繞目標區(qū)域。
2）、PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴增DNA模板的數(shù)量。
3）、PCR反應中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。
3、 熒光實時檢測：
1）、使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。
2）、熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴增的DNA數(shù)量成比例。
3）、使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
根據(jù)所使用的技術(shù)不同，實時熒光定量PCR可以分為：熒光探針和熒光染料兩種方法。
現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針
TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的shou選技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是：
① 開始反應，當SYBR染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光；
② DNA變性時，SYBR染料釋放出來，熒光急劇減少；
③ 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR引物；
④ 聚合完成后，SYBR染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
實時熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)化學原理可以分為探針類和非探針類。探針類實時熒光定量 PCR 技術(shù)主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；非探針類實時熒光定量 PCR 技 術(shù)主要通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。無論是探針類實時熒光 定量 PCR 技術(shù)還是非探針類實時熒光定量 PCR 技術(shù)，檢測的都是 擴增產(chǎn)物的增加量。但探針類實時熒光定量 PCR 技術(shù)增加了識別 探針的具體的流程，操作的難度較大。