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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的大鼠心臟干采用機械剪碎組織、膠原酶分次消化法結合差速貼壁、心臟干細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

公司實驗室分離的大鼠心臟干經c-kit免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

大鼠心臟干細胞分離自心臟組織；心臟是脊椎動物身體中重要的一個器官，主要功能是為血液流動提供壓力，把血液運行至身體各個部分。心臟由心肌構成，左心房、左心室、右心房、右心室四個腔組成。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開，故互不相通，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣），這些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應氧和各種營養(yǎng)物質，并帶走代謝的終產物（如二氧化碳、無機鹽、尿素和尿酸等），使細胞維持正常的代謝和功能。研究發(fā)現(xiàn)，心臟干細胞是一種多潛能細胞，具有再生和克隆能力，并可分化為心肌細胞、平滑肌細胞和血管內皮細胞。體內研究顯示，從心臟中分離出的心臟干細胞，經體外簡單培養(yǎng)、增殖和標記后，移植到心肌梗死邊緣區(qū)域，心梗血流動力學和心室壁厚度較對照組明顯改善，心肌梗死邊緣區(qū)域發(fā)現(xiàn)有標記的心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞。盡管其新生心肌細胞較小，但表達一些特殊肌蛋白如心臟肌球蛋白重鏈、α-肌動蛋白、α-輔肌動蛋白、連接蛋白等，證實了心臟干細胞對心肌梗死的修復作用。干細胞移植治療是目前心肌梗死和缺血性心臟病細胞重建的主要方法，成體干細胞中的c-kit陽性心臟干細胞因其來源于心臟，有定向心臟細胞系分化的趨勢，體內外可以分化成心肌細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞，同時自體移植不存在免疫排斥反應及倫理問題已經成為目前研究的熱點。短期內獲得治療量的自體心臟干細胞是這一治療應用于臨床的關鍵所在。因此，研究一種新的分離培養(yǎng)方法可在短時期內獲得大量純度較高的自體c-kit陽性心臟干細胞成為目前干細胞領域研究的熱點問題之一。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 長梭形

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

公司產品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。