产品名称；禽流感病毒H5亚型RT-PCR检测试剂盒

产品规格：50次

产品用途：检测H5亚型禽流感病毒

检测样本：咽肛拭子，喉气管、胸肌、心肌和肺等组织，血清

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产品部分说明如下，由于篇幅限制，如需更加详细说明书请联系--。

禽流感病毒H5亚型RT-PCR检测试剂盒需要自备的物品

1．仪器：分析天平、水浴锅、离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。

2．耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）、灭菌双蒸水。

注意事项

1．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。

2．PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应*融化，8000 rpm离心15 s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20 ℃。

4．消化液低温时可能出现结晶，请于37 ℃温育，溶解至澄清透明后使用。

5． 染色液低毒，操作时应戴上手套，避光保存，较长时间不使用请存放于4℃，以免挥发变干。染色液和上样缓冲液使用前也请离心使液体沉于管底。

6．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。

7．严格遵守操作说明可以获得好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

8．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在3次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。

样品制备

1 样品采集：病死或扑杀的动物，取肺、淋巴结等组织；待检活动物，用注射器取血5 mL。2～8 ℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。）

2 样品处理：每份样品分别处理。

2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取上清液100 μL于1.5 mL灭菌离心管中，再加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56 ℃水浴中消化1小时。

2.2 全血样品处理：待血凝后取血清100 μL，加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56 ℃水浴中消化1小时。

2.3 阳性对照处理：取阳性对照100 μL，加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56 ℃水浴中消化1小时。

2.4 阴性对照处理：取阴性对照100 μL，加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振荡混匀后，置56 ℃水浴中消化1小时。

操作步骤

1 病毒DNA的提取

1.1 从水浴锅中取出样品管，降至室温后，加入300 μL DNA结合液，颠倒混匀，将全部液体移入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），室温静置3 min，10000 rpm离心30 s。

1.2 弃去收集管中液体，加入500 μL DNA洗涤液，10000 rpm离心30 s。

1.3 重复步骤1.2。

1.4 弃去收集管中液体，10000 rpm空柱离心1 min，以除去残留的DNA洗涤液。

1.5将吸附柱放入新的1.5 mL离心管中，向柱中央加入DNA洗脱液（56 ℃预热）50 μL，室温放置2 min，10000 rpm离心30 s，离心管中液体即为模板DNA。

2 PCR扩增

每份总体积20 μL，含16 μL PCR反应液（用前混匀），2 μL Taq DNA聚合酶，2 μL模板DNA。

例如：n份样品，配制n+1份，16×（n+1）PCR反应液，再加入2×（n+1）Taq DNA聚合酶，混匀后取18 μL分装成n份，分别加入2 μL模板DNA，加入20 μL矿物油覆盖（有热盖的PCR扩增仪不用加），作好标记。

在PCR扩增仪上进行以下程序：94 ℃ 3 min；循环94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35次；再72 ℃延伸10 min。

3电泳

称2 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200 mL（取4 mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200 mL），于微波炉中熔解，再加入10 μL 染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10 μL混合2 μL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120 V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

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