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實驗方法原理    

實驗材料    CB-MNCs
試劑、試劑盒    滅菌培養(yǎng)基過柱緩沖液FcR阻斷劑CD34微球
儀器、耗材    柱子（MS+ RS+或LS+ VS+)磁珠細(xì)胞分離儀尼龍過濾網(wǎng) 30μm
實驗步驟    
(a)準(zhǔn)備過柱緩沖液，用抽真空裝置去除氣體。

(b)每108個CB-MNCs用終體積300μL緩沖液重懸。

(c)每108個CB-MNCs懸液加100μL FcR阻斷劑，抑制CD34微珠非特異性結(jié)合或通過Fc受體介導(dǎo)與非靶細(xì)胞的結(jié)合。

(d)每108個CB-MNCs懸液加100μL CD34微球進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，充分混勻后在6?12℃冰箱放置30min。

(e)加PBSA洗，室溫200g離心10min;加適量的緩沖液重選細(xì)胞。

(f)根據(jù)CB-MNCs的細(xì)胞總數(shù)選擇合適的柱子類型（MS+/RS+或LS+/VS+)，將柱子放人MACs分離儀的磁場中。加人緩沖液潤洗柱子（MS+/RS+:50μL;LS+/VS：3mL)。

(g)用30μm的尼龍過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，去除細(xì)胞團(tuán)。使用前，用緩沖液濕潤柱子。

(h)將細(xì)胞懸液加人柱子，使未結(jié)合的細(xì)胞通過柱子。

(i)用緩沖液將未結(jié)合的細(xì)胞洗去（MS+/RS+:3×500μL;LS+/VS:3×3mL)。

(j)洗脫結(jié)合的細(xì)胞。將柱子從分離儀中移出。置于合適的管中。將柱子加滿緩沖液（MS+/RS+:1mL;LS+/VS: 5mL)。用柱子隨帶的內(nèi)塞，加壓將結(jié)合的細(xì)胞沖洗出來。

(k)加PBSA將CD34+細(xì)胞洗一遍，室溫200g離心l0min。用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基重懸細(xì)胞。
體外擴(kuò)增CD34+細(xì)胞
實驗方法原理    ，
實驗材料    CD34+細(xì)胞
試劑、試劑盒    ?滅菌培養(yǎng)基；*IMDM細(xì)胞因子（Flt-3配體干細(xì)胞因子促血小板生成素IL-6)
儀器、耗材    培養(yǎng)瓶
實驗步驟    
(a)用添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（50 ng/mL Flt-3配體，50 ng/mL干細(xì)胞因子，20 ng/mL促血小板生成素和10 ng/mL IL-6)。

(b)按2×104個細(xì)胞/mL的細(xì)胞濃度將CD34+細(xì)胞接種到T25培養(yǎng)瓶中。

(C)每周兩次半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子。
飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)體外擴(kuò)增CD34+細(xì)胞
驗方法原理    
實驗材料    CD34+細(xì)胞
試劑、試劑盒    ?滅菌MSCs培養(yǎng)基C100μg mL共培養(yǎng)的培養(yǎng)基細(xì)胞因子（干細(xì)胞因子IL-6Flt-3配體促血小板生成素）
儀器、耗材    6孔培養(yǎng)板
實驗步驟    
(a)將臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，用MSCs培養(yǎng)基重懸CB-MSCs，細(xì)胞濃度為5×104個細(xì)胞/mL。

(b)將CB-MSCs接種到6孔板

(C)每周兩次半量更換新鮮培養(yǎng)基。

(d)當(dāng)CB-MSCs達(dá)到以上匯合時，用10μg/mLc處理,37℃ 2.5 h„

(e)用無血清IMDM將CB-MSCs洗兩遍。

(f)按1×104個/mL CD34+細(xì)胞重懸于含細(xì)胞因子的共同培養(yǎng)基（100 ng/mL干細(xì)胞因子，100ng/mL IL-6,50 ng/mLFlt-3配體，10 ng/mL促血小板生成素）。

(g)將CD34+細(xì)胞接種到CB-MSCs飼養(yǎng)層細(xì)胞上。

(h)每周兩次更換1/4培養(yǎng)基。

(i)2周后，收集未貼壁細(xì)胞