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分離微管和微管相關(guān)蛋白實驗
閱讀：630 發(fā)布時間：2019-2-25| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.4KB |
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實驗材料 腦組織
試劑、試劑盒 PME 緩沖液
儀器、耗材 勻漿器
實驗步驟
1. 收集腦組織（幾百克）
(1) 如果從屠宰場取腦（豬）
① 只要美國地方檢察官允許，在宰殺后盡快收集腦（豬 )。
② 把腦一個一個地放在薄塑料袋里，立即浸入冰水混合物中，運到實驗室。
③ 在冰庫里，研究者帶著橡膠手套取出腦、表面的血管、血凝塊和腦膜。
④ 用剪刀把腦剪成小塊（1~2 cm），放到冰浴的小燒杯中。
(2) 如果是買的雞
① 用鋒利的剪刀將雞斷頭。
② 將腦取出放到冰浴的燒杯中。
2. 每克腦加 1 ml PME，在一個 50 ml 用馬達(dá)驅(qū)動（3000 r/min）的勻漿器中用研杵上下各 7 次進(jìn)行勻漿。這種勻漿器是玻璃筒，Teflon 研杵；每次處理 20~25 g。
PME 緩沖液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L GTP
3. 勻漿物在 4℃ 以 40000 g 離心 45 分鐘。把上清轉(zhuǎn)移到一個新管中，上清里含冰冷的溶解了的微管蛋白二聚體和微管相關(guān)蛋白。
4. 上清在 37℃ 溫育 30~45 分鐘。
5. 在 25℃ 以 40000 g 離心 30 分鐘收集組裝了的微管。用一個 Dounce 的勻漿器，用步驟 2 中使用的緩沖液以 1/5~1/4 的體積重懸所得到的微管沉淀物，重懸的微管放到一個干凈的離心管中。
6. 在冰/水混和物中冰浴 30 分鐘。
7. 在 4℃ 以 40000 g 離心 30 分鐘使溶液變清。
8. 步驟 7 中得到的微管蛋白通過重復(fù)步驟 4 和 5 再做一輪組裝。