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傳代細胞培養(yǎng)實驗
閱讀：501 發(fā)布時間：2018-12-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 662.8KB |
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傳代細胞培養(yǎng)實驗
實驗方法原理
當原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一方面細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于細胞生長甚至發(fā)生中毒，如果不及時的減少細胞密度，細胞將逐漸衰老死亡。因此需要將培養(yǎng)物按照比例重新接種到新的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化把細胞分散成單細胞再傳代，而懸浮型生長細胞的傳代則用直接傳代法或離心法傳代。細胞種類不同，所需的培養(yǎng)基、添加劑以及傳代培養(yǎng)的操作都會有所不同，
實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 Hanks胰蛋白酶EDTA培養(yǎng)液
儀器、耗材 吸管培養(yǎng)瓶
實驗步驟
一、貼壁細胞：HeLa細胞的傳代培養(yǎng)
1. 選取生長密度80%左右的HeLa細胞，在生物安全柜中操作，吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入2 mL的D-Hanks溶液，漂洗細胞以除去殘留的血清。
2. 吸去培養(yǎng)皿中的D-Hanks溶液，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化2～3 min(如消化程度不夠，可延長時間)，倒置顯微鏡下觀察細胞，當大部分細胞變圓時，輕輕吸去酶消化液（如果有較多細胞漂起，需要直接加入*培養(yǎng)基來終止胰蛋白酶的消化反應）。
3. 加入4 mL*培養(yǎng)基，用移液管反復吹打細胞成為細胞懸液。將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。
4. 輕輕吸去上清后用*培養(yǎng)基重懸細胞，把細胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉移到新的培養(yǎng)皿中。
5. 接種好的細胞，應在培養(yǎng)皿上標記上細胞名稱、本次傳代日期和操作人，輕輕搖勻后轉移到CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。
6. 細胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細胞的生長密度進行相應的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）。
二、懸浮細胞或半貼壁細胞的傳代培養(yǎng)
懸浮細胞不貼壁（半貼壁細胞貼壁不緊），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具體過程如下：
1. 取狀態(tài)良好的細胞，在生物安全柜中操作，用移液管把細胞吹打均勻。
2. 把細胞懸液轉移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。
3. 輕輕吸去上清后用*培養(yǎng)基重懸細胞，把細胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉移到新的培養(yǎng)皿中。
4. 接種好的細胞，應在培養(yǎng)皿上標記上細胞名稱、本次傳代日期和操作人．輕輕搖勻后轉移到CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。
5. 細胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細胞的生長密度進行相應的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）。
收起
注意事項
1. 把握發(fā)了傳代時機，已如前述，在80%~90%匯合階段，過早傳代細胞產(chǎn)量少，過晚細胞健康狀態(tài)不佳。
2. 消化時間要適度，過短細胞不易從瓶壁脫落，過長細胞可脫落流失。
3. 消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。
4. 各種細胞對消化反應不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應根據(jù)所用細胞特點制定適宜消化措施。有的細胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來，但這樣容易傷害細胞，細胞大片脫落掉，不易計數(shù)，應盡可能采用消化法分散細胞為妥。
5. 消化傳代良好時，細胞受損害少，細胞懸液均勻，各分裝樣品中數(shù)量誤差小，細胞生長增殖速度一致，實驗結果可靠性大。