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T、B淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn)
閱讀：214 發(fā)布時間：2018-7-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 22KB |
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實(shí)驗(yàn)原理
本試驗(yàn)的原理為：淋巴細(xì)胞與用溴花二氨基異硫氫化物(簡稱AET)處理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)混合后，其中全部T淋巴細(xì)胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E—花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時，AET—E花環(huán)易沉于管底，而未形成E—花環(huán)的T淋巴細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周圍的 AET—SRBC，便可獲得純T淋巴細(xì)胞，而B淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 溴花二氨基異硫氫化物(AET)
2. 淋巴細(xì)胞分層液
3. 其它Hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無菌生理鹽水，3.5%氯化鈉溶液等。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
離心機(jī)，冰箱等。
實(shí)驗(yàn)材料
1. 新鮮豚鼠血
2. 兔紅細(xì)胞(RRBC)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. AET—RRBC制備
1) AET溶液的制備
稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143M溶液，用4N NaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。
2) AET處理RRBC
取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口(1—2厘米)1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3—5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET—RRBC粘附成團(tuán)，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次，后配成10%AET—RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。
3) 1%AET—RRBC的配制：
將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。
2. 從新鮮豚鼠血液分離單個核細(xì)胞，操作見后試驗(yàn)。
3. AET—E花環(huán)試驗(yàn)：
將分離的單個核細(xì)胞(2ⅹ106/毫升)與等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2—3毫升，低速離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。
4. T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分離
將形成E—花環(huán)的細(xì)胞懸液，再用淋巴細(xì)胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細(xì)胞，即為富含B淋巴細(xì)胞群。沉淀于管底的E—花環(huán)，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E—花環(huán)周圍的RRBC，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細(xì)胞群。