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免疫組化SABC法與SV法
閱讀：339 發(fā)布時間：2018-7-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 82.1KB |
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實驗原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一種顯示組織和細胞中抗原分布的簡便而敏感的免疫組化染色方法。
親和素(Avidin)存在于雞蛋中，分子量67000。是一種堿性蛋白質(zhì)，具有對生物素近乎于共價鍵的結(jié)合力。鏈霉親和素是一種從鏈霉菌(Streptomyces Avidinii)培養(yǎng)物中所提取的蛋白質(zhì)，分子量47000，不含糖鏈，等電點IP=6.0-6.5。和親和素一樣，也有四個生物素結(jié)合位點，親和力高達10-15M。和親和素相比，鏈霉親和素更為?，F(xiàn)在經(jīng)過改進的親和素等電點IP可以達到7.0，明顯地消除了原堿性蛋白特征所引起的非特異性吸附。
生物素是一種水溶性維生素(即維生素H)，分子量244。生物素活化后，可以標記抗體和酶而不影響其活性。鏈霉親和素—酶復合物可以起到放大信號的作用，這是SABC具有高度敏感性的基礎。
SV(Super Vision)兩步法：是用聚合標記方法將過氧化物酶連接到二抗上，形成類似于章魚的超大分子抗體-酶聚合物，替代傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗。這種聚合物擁有強大的信號放大能力，同時有很強的組織細胞滲透力，經(jīng)檢測其靈敏度高于同類產(chǎn)品，特別是針對核抗原，其滲透性特別強，適合免疫組化的應用。此系列檢測試劑與傳統(tǒng)的三步法比較具有簡單，快速，高敏感，低背景等特點。
原理示意圖：
實驗試劑
1. 即用型SABC(過氧化物酶)試劑盒(博士德貨號SA1021，SA1022)
2. 即用型SV(HRP辣根過氧化物酶)試劑盒(博士德貨號SV0001，SV0002)
3. DAB(黃色，博士德貨號AR1022)
4. Mayor`s蘇木素(博士德貨號AR0005)
5. 所選一抗：KCA3.1(BA1788)；PCNA(BM0104)；Vimentin(BM0135)( 博士德公司)
6. 3%H2O2
7. 5%BSA封閉液
8. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)
9. 飽和Na2HPO4溶液
10. 中性樹膠
實驗設備
微波爐，37℃恒溫箱，超薄切片機
實驗材料
乳腺癌石蠟切片，腸癌石蠟切片，切片厚度為5微米
實驗步驟
SABC法：
1. 切片脫蠟至水；
2. 新鮮配置3%H2O2，室溫10分鐘，滅活內(nèi)源性酶，然后用蒸餾水沖洗2分鐘三次；
3. 微波修復：將切片放入盛有PBS緩沖液(PH7.2-7.6)的杯子中，在微波爐里加熱煮沸，微波爐中靜置５分鐘，拿出室溫冷卻６分鐘，再微波續(xù)熱至沸騰后*室溫冷卻；
4. 滴加5%BSA封閉液，37℃反應30分鐘。甩去多余液體，不洗；
5. 滴加一抗，4℃反應過夜。所配一抗的濃度為1µg/ml；
6. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次，滴加生物素化二抗IgG(抗兔或抗鼠)37℃反應30分鐘；
7. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次，滴加試劑SABC，37℃反應30分鐘，PBS洗30分鐘×3次；
8. DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌；
9. 滴加蘇木素輕度復染60秒，蒸餾水洗滌后浸入飽和Na2HPO4溶液中2分鐘，取出后洗滌，37℃恒溫箱干燥過夜，中性樹膠封片。
SV法：
1. 切片脫蠟至水；
2. 新鮮配置3%H2O2，室溫10分鐘，滅活內(nèi)源性酶，然后用蒸餾水沖洗2分鐘三次；
3. 微波修復：將切片放入盛有PBS緩沖液(PH7.2-7.6)的杯子中，在微波爐里加熱煮沸，微波爐中靜置5分鐘，拿出室溫冷卻６分鐘，再微波續(xù)熱至沸騰后*室溫冷卻；
4. 滴加5%BSA封閉液，37℃反應30分鐘。甩去多余液體，不洗；
5. 滴加一抗，4℃反應過夜，所配一抗的濃度為1µg/ml；
6. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次，滴加HRP標記二抗IgG (抗兔或抗鼠)37℃反應30分鐘，PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗30分鐘×3次；
7. DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌；
8. 滴加蘇木素輕度復染60秒，蒸餾水洗滌后浸入飽和Na2HPO4溶液中2分鐘，取出后洗滌，37℃恒溫箱干燥過夜，中性樹膠封片。