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酸性磷酸酶（ACP）活性測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

                                                  分光光度法50管/24樣

 

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：                           

ACP在酸性條件下催化磷酸單酯水解稱無(wú)機(jī)磷酸，常見于巨噬細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。ACP常用于前列腺癌的輔助診斷。

 

測(cè)定原理：

在酸性環(huán)境中，ACP催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉水解生成4-硝基苯酚，在405nm有特征光吸收；通過(guò)測(cè)定405nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算ACP活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、分析天平、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

 

試劑組成和配制：

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體25mL×1瓶，4℃保存。

 酸性磷酸酶（ACP）活性測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，4℃、10000g離心10min，取上清液待測(cè)。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血液可直接測(cè)定，或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。

 

測(cè)定：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到405 nm。

2. 在 EP 管中加入下列試劑

混勻，吸取 1 mL 加入玻璃比色皿中，405 nm 下測(cè)定各管吸光值。ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

注意：每個(gè)測(cè)定管需做一個(gè)對(duì)照管。

 酸性磷酸酶（ACP）活性測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

 

ACP活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 14.6672x + 0.0179；R² = 0.9996；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值ΔA。

1. 血液中ACP活性計(jì)算

活性單位定義：30℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚定義為1個(gè)酶活單位。

ACP活力(μmol/min/mL)=（ΔA-0.0179）÷14.6672 ×V反總÷T÷V樣

= 0.2273 ×（ΔA-0.0179）

2. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ACP活性計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：30℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol 4-硝基苯酚定義為1個(gè)酶活單位。

ACP活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0179)÷14.6672×V反總÷T÷(V樣×Cpr)

=0.2273 ×（ΔA-0.0179）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：30℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol 4-硝基苯酚定義為1個(gè)酶活單位。

ACP活力 (μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0179)÷14.6672×V反總÷T÷(W×V 樣÷V 樣總)

= 0.2273 ×（ΔA-0.0179）÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：30℃中每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol 4-硝基苯酚定義為1個(gè)酶活單位。

ACP活力 (μmol/min/10⁴ cell)=(ΔA-0.0179)÷14.6672 ×V反總÷T ÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）

= 0.2273 ×（ΔA-0.0179）÷細(xì)胞數(shù)量

V反總：反應(yīng)體系總體積（mL），1 mL； W ：樣品質(zhì)量，g； V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積（mL），0.01 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），30 min；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

 

注意事項(xiàng)：

ACP不穩(wěn)定，尤其在37℃和pH大于7的條件下活力喪失快，因此酸性磷酸酶樣品一般需當(dāng)天準(zhǔn)備；血清樣品中，每毫升血清中加入10mg檸檬酸氫二鈉或者5mg硫酸氫鈉，使pH降至6.5以下，或5ml血清加入30%醋酸溶液2～3滴，置于4℃可保存1周。

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