化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
WB內(nèi)參選擇知多少？
閱讀：1828 發(fā)布時(shí)間：2021-2-20免疫印跡技術(shù) (Western blotting, WB) 是蛋白定性和定量的金標(biāo)準(zhǔn)，因此廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究。由于Western blot檢測(cè)包含多個(gè)步驟，樣品制備、上樣或轉(zhuǎn)膜等實(shí)驗(yàn)過(guò)程中任何細(xì)微的差異，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)論的不一致性，甚至*相悖。為了避免實(shí)驗(yàn)操作差異引起誤差，在任何WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，都需要設(shè)定合適的內(nèi)參。
WB常見(jiàn)的應(yīng)用是研究生物樣品中蛋白質(zhì)豐度的變化。內(nèi)參的信號(hào)通常用來(lái)對(duì)目的蛋白的信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，需要強(qiáng)調(diào)的是內(nèi)參抗體應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)抗體在相同的印跡上進(jìn)行。因此選擇的內(nèi)參蛋白必須是實(shí)驗(yàn)樣本中穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，一般會(huì)選擇組成型表達(dá)且是細(xì)胞基本功能必需的管家蛋白如細(xì)胞骨架蛋白作為內(nèi)參。但是進(jìn)一步的研究表明，管家蛋白的表達(dá)并不恒定，會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件的改變而改變。
選擇內(nèi)參應(yīng)遵循以下原則
表達(dá)水平：內(nèi)參蛋白應(yīng)在實(shí)驗(yàn)樣本中高表達(dá)；
豐度相似性：實(shí)驗(yàn)樣本中內(nèi)參蛋白的表達(dá)豐度應(yīng)與目的蛋白的豐度有相似性，實(shí)驗(yàn)方案和檢測(cè)方法可以揭示內(nèi)參蛋白和目標(biāo)蛋白水平的變化，而不會(huì)出現(xiàn)信號(hào)飽和；（如果內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目的蛋白，必須對(duì)內(nèi)參蛋白進(jìn)行梯度稀釋以確定內(nèi)參蛋白的檢測(cè)范圍）。
內(nèi)參蛋白有多種多樣的選擇，隨機(jī)選擇beta-Actin或alpha-Tubulin作為內(nèi)參并不能滿足所有的WB實(shí)驗(yàn)，對(duì)于不同特性的WB，尋找合適的內(nèi)參是特定WB成功的關(guān)鍵。我們?cè)谶@里列出了內(nèi)參選擇需要遵循的原則以便大家更好的選擇合適的內(nèi)參。
選擇內(nèi)參應(yīng)遵循以下原則
穩(wěn)定表達(dá)：在特定實(shí)驗(yàn)條件下（如特殊的實(shí)驗(yàn)處理或不同的發(fā)育階段），內(nèi)參蛋白的水平相對(duì)于總蛋白保持恒定；
表達(dá)水平：內(nèi)參蛋白應(yīng)在實(shí)驗(yàn)樣本中高表達(dá)；
豐度相似性：實(shí)驗(yàn)樣本中內(nèi)參蛋白的表達(dá)豐度應(yīng)與目的蛋白的豐度有相似性，實(shí)驗(yàn)方案和檢測(cè)方法可以揭示內(nèi)參蛋白和目標(biāo)蛋白水平的變化，而不會(huì)出現(xiàn)信號(hào)飽和；（如果內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目的蛋白，必須對(duì)內(nèi)參蛋白進(jìn)行梯度稀釋以確定內(nèi)參蛋白的檢測(cè)范圍）。
