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多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）試劑盒說明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶，

能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在 525nm有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔

板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：10mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10

4 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超

聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃

離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加

入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清

（漿）或果汁加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管

試劑一 200 200

試劑二 50 50

樣本 50

煮沸的樣本 50

37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴10min 后迅速放入冰浴中冷卻

試劑三 100 100

充分混勻，10000g，常溫離心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm

處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度，計(jì)算 ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。

注意：每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管?？梢栽诓煌瑢?duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集

中進(jìn)行 1min 沸水浴處理。

PPO 活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01

為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力

單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

PPO（U/10

4cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.16×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL；V 樣：加入樣

本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)

濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005

為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷V 液

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活

力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =160×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單

位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

PPO（U/10

4cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =0.32×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL； V 樣：加入

樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白

質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)