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大腸桿菌轉化實驗 熱擊法
閱讀：624 發(fā)布時間：2020-9-25熱擊法
實驗方法原理 質粒DNA或重組DNA粘附在細菌細胞表面，經過42攝氏度短時間的熱擊處理，促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
實驗材料
質粒DNA 重組DNA
試劑、試劑盒
LB培養(yǎng)基 蒸餾水 IPTG X-gal 氨芐青霉素
儀器、耗材
旋渦混合器 微量移液取樣器 移液器吸頭 離心管 雙面微量離心管架 干式恒溫氣浴 恒溫水浴鍋 制冰機 恒溫搖床 培養(yǎng)皿 超凈工作臺 酒精燈 玻璃涂棒 恒溫培養(yǎng)箱
實驗步驟
一、實驗材料準備
1. 器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。
2. 試劑
培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。
3. 材料處理
無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
二、操作步驟
1. 事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。
2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 ul）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
3. 加入5 ul 連接好的質?；旌弦海―NA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。
4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5 min。
5. 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 ul LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。
6. 在超凈工作臺中取上述轉化混合液100-300 ul，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal，8 ul 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。
9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。
10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。
注意事項
1. 電擊之前保持低溫狀態(tài)。
2.電擊杯使用完，用針頭蒸餾水反復沖洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20℃冰箱存放。
3.玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂。