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臨床PCR實(shí)驗(yàn)攻略
閱讀：10075 發(fā)布時間：2019-11-29基礎(chǔ)篇
一、如何選擇試劑，評價試劑是否符合自己實(shí)驗(yàn)室條件？
現(xiàn)在臨床PCR實(shí)驗(yàn)室使用的試劑大部分都是各生產(chǎn)企業(yè)提供的商品化的試劑盒，那么試劑質(zhì)量的好壞直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞，而不同廠家試劑的性能、質(zhì)量和價格千差萬別，如何選擇一款合適的試劑對每個PCR實(shí)驗(yàn)室都至關(guān)重要，一般來說，選擇試劑主要從以下幾個方面進(jìn)行評價：
1、重復(fù)性
首先，試劑檢測結(jié)果的重復(fù)性直接展現(xiàn)了試劑的方法學(xué)及其質(zhì)量的好壞，是評價試劑好壞明顯、直接的指標(biāo)。
其次，我們在此說的試劑重復(fù)性是指對原始樣本檢測的重復(fù)性，而不是對某一個樣本提取的核酸進(jìn)行重復(fù)性的檢測和評價。
后，試劑的重復(fù)性對于療效檢測、用藥指導(dǎo)有著重大的意義，一個重復(fù)性好的試劑，往往能夠在病人的抗病毒治療過程中，給醫(yī)生和病人提供直接、可靠的數(shù)據(jù)，讓醫(yī)生和病人對疾病進(jìn)展有更清楚的認(rèn)識，從而制定合理的治療方案，實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。
2、靈敏度
一個試劑的靈敏度往往能夠體現(xiàn)該試劑的技術(shù)水平和先進(jìn)程度，同時對于臨床病癥的監(jiān)測有著舉足輕重的意義。以乙肝為例來說，我國的乙肝復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于發(fā)達(dá)國家，同時由乙肝病毒感染轉(zhuǎn)換為慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，這很大程度上與對低載量病毒監(jiān)控的嚴(yán)重不足有關(guān)。美國肝病學(xué)會專家組就提出，對乙肝抗病毒治療過程中，HBV DNA的低監(jiān)測點(diǎn)應(yīng)設(shè)置為10IU/ml，而歐洲和亞太肝病學(xué)也指出HBV DNA病毒載量應(yīng)該盡可能小于10IU/ml。這都足以證明，高靈敏度對于用藥治療、病程監(jiān)控等起著巨大的作用，靈敏度越高，對于疾病的監(jiān)控效果更好，對于確定治療的終點(diǎn)，具有積極的指導(dǎo)作用。
3、定量準(zhǔn)確性
對于臨床檢測中定量項(xiàng)目來說，試劑盒定量的準(zhǔn)確性是非常重要的，也是評價定量試劑盒的一個重要指標(biāo)之一。衛(wèi)生部每年都會有2次全國性的室間質(zhì)評，通過質(zhì)評結(jié)果可以很好的看出試劑盒定量的準(zhǔn)確性。
但往往很多時候，實(shí)驗(yàn)室在選擇試劑的時候都偏重與過去的試劑盒比較定量結(jié)果的差異，并以過去的試劑盒定值作為標(biāo)準(zhǔn)來參考和評價一種新試劑，其實(shí)這種方法不*可取。不過可以通過同時檢測衛(wèi)生部的質(zhì)控品來進(jìn)行比較，這樣才使得兩種試劑在同一客觀標(biāo)準(zhǔn)上進(jìn)行PK，得到合理公平的評價。
同時，要驗(yàn)證一個試劑的定量是否準(zhǔn)確，我們可以采用一個高濃度樣本，用陰性血清依次進(jìn)行10倍梯度的稀釋，然后選取多家試劑公司的產(chǎn)品進(jìn)行同步檢測PK，考察各公司試劑對樣本定值的實(shí)際值與理論值的差異，即可判斷各公司試劑定量準(zhǔn)確與否。
4、有無內(nèi)標(biāo)監(jiān)測
內(nèi)標(biāo)的一個主要的作用就是控制假陰性結(jié)果的發(fā)生，但在國內(nèi)臨床檢測中往往被忽視了，這主要與兩個方面有關(guān)，一個是之前國內(nèi)使用的很多熒光定量PCR儀均為單通道的儀器，無法進(jìn)行多色熒光的檢測；國內(nèi)外PCR行業(yè)對內(nèi)標(biāo)的研究已不是一個新興課題，目前國內(nèi)PCR行業(yè)能把內(nèi)標(biāo)做得非常好的科研單位或商業(yè)化的PCR試劑廠家，這正體現(xiàn)了這一技術(shù)的難度。
在臨床檢測中，內(nèi)標(biāo)的作用非常重要。在臨床檢測過程中，怎么做到每一個陰性結(jié)果均為真正的陰性結(jié)果，從而杜絕因擴(kuò)增抑制而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果呢？內(nèi)標(biāo)的加入就能夠很好的防止假陰性結(jié)果了，加入我們做了一個樣本，它的目標(biāo)檢測熒光為陰性，內(nèi)標(biāo)檢測熒光也為陰性，那么這個樣本的擴(kuò)增則受到了抑制，該陰性結(jié)果為假陰性，我們必須對該樣本進(jìn)行復(fù)檢。如果試劑沒有內(nèi)標(biāo)的話，我們則不能很好的判斷該結(jié)果是否正常？是否可以發(fā)報告？在發(fā)報告時，我們無法保證發(fā)出去的結(jié)果的準(zhǔn)確；內(nèi)標(biāo)的加入，就可以解決我們這方面的煩惱。目前，衛(wèi)生部的專家也在大力推崇內(nèi)標(biāo)的重要性，也是為了保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。
5、線性定量范圍
試劑盒的線性定量范圍指的是試劑盒低檢測下限和高檢測上限之間的范圍，范圍越寬說明試劑盒性能越好。
6、UNG酶防污染體系
PCR反應(yīng)過程中， 1個拷貝的DNA經(jīng)過30個循環(huán)后，可以增長到10億個拷貝的產(chǎn)物DNA， 極微量的PCR 產(chǎn)物污染，就可能造成假陽性，因而這是一個值得特別重視的問題。
尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：將PCR 產(chǎn)物中的dT用dU 代替。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響，UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
此外，試劑的穩(wěn)定性、批間差、溯源性（是否溯源于WHO標(biāo)準(zhǔn)品）等也都是考察一款試劑盒質(zhì)量重要指標(biāo)。
二、如何選擇熒光定量PCR儀器？
1、儀器使用的廣泛程度
如果不是一個新出現(xiàn)的儀器品牌，為保證所購置的儀器有充分的可靠性，臨床PCR實(shí)驗(yàn)室可以從相應(yīng)儀器在國內(nèi)外使用的廣泛程度來判斷。應(yīng)用越是廣泛的儀器，越是經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證的，也就越具有可靠性。
2、儀器的檢測通量（反應(yīng)孔數(shù)）
在購買定量PCR儀的時候需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的要求來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR儀的檢測通量小到16多到384孔，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的檢測項(xiàng)目和發(fā)展?fàn)顩r，選擇合適的儀器，沒必要追求昂貴的儀器，一般來說，96孔的通量足夠用了；如需尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記等類型的實(shí)驗(yàn)，則可以考慮購買384孔的儀器。
3、儀器的通道數(shù)量
隨著醫(yī)院開展的項(xiàng)目越來越多，比如基因表達(dá)，單核苷酸多態(tài)性分析、高分辨率熔解曲線等，那么單通道的儀器則無法滿足實(shí)驗(yàn)室的需求了，而多通道的設(shè)計則能使其更方便地檢測多重PCR檢測及其衍生的基因表達(dá)等其他分析模式。
4、耗材的開放性
耗材如擴(kuò)增反應(yīng)管的開放性可能會決定日常檢測成本的高低。作為臨床PCR實(shí)驗(yàn)室，在選擇實(shí)時熒光PCR儀時，可考慮這一點(diǎn)。不過對于檢測HCV等RNA項(xiàng)目的時候，盡量使用去RNAnase酶耗材。
5、硬件設(shè)計特點(diǎn)
熒光定量PCR儀主要有96孔板式和離心式等，每種設(shè)計都有它的獨(dú)到之處，但也都有無法避免的缺陷。
96孔板的熒光定量PCR儀可以容納的樣本量大，大可至100ul，而且無需特殊的耗材。傳統(tǒng)的96孔板儀器多采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測。其優(yōu)點(diǎn)在于：鹵鎢燈的光強(qiáng)比LED燈強(qiáng)，波長范圍廣，對于熒光染料的激發(fā)具有非常好的效果，性能比較穩(wěn)定，使用壽命約3000個小時左右；但CCD的檢測通常會因?yàn)槊總€樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同，會產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。為了保證、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常需要配合ROX校正染料，來平衡孔間差異；
離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，設(shè)計上避免了邊緣效應(yīng)，同時PMT檢測對熒光信號可以放大或縮小，相對于CCD檢測更加靈活，靈敏度更高；但LED的熒光強(qiáng)度比較弱，波長范圍也比較窄，因此，對熒光染料的激發(fā)效果不如鹵鎢燈；
6、運(yùn)行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也是非常重要的。更快的升降溫，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合和反應(yīng)時間，提高PCR的特異性。但是，運(yùn)行速度越快，對加熱制冷模塊的要求越高，因此，穩(wěn)定性是其存在的大問題，如果在市面上經(jīng)過長期考證的，穩(wěn)定性好的儀器，運(yùn)行速度越快，帶來的便捷越多；
7、靈活性
在儀器基本性能得到保證的情況下，另外一方面則需要考慮儀器的靈活性，主要包括：儀器運(yùn)輸?shù)撵`活性，拆卸的靈活性，軟件升級的靈活性，模塊更換的靈活性以及使用的靈活性等。
三、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室硬件基本要求是什么？
（1）實(shí)驗(yàn)室整體布局：
根據(jù)衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號）要求，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室原則上分為四個單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)，也可以將后兩個區(qū)域合為一個區(qū)，即擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計時按照《辦法》規(guī)定，三個區(qū)域相互獨(dú)立，并有各自的緩沖區(qū)域。
（2）各工作區(qū)域儀器設(shè)備
各工作區(qū)域的儀器設(shè)備及物品，包括椅子、辦公用品、清潔用品等均不能拿出本區(qū)域，所有可移動物品均應(yīng)有本區(qū)域的標(biāo)示。
各區(qū)域應(yīng)具備的設(shè)備配置為：屋頂紫外燈、近臺紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙簍、微量加樣器（覆蓋1-1000ul），經(jīng)高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）、筆、紙等。
各工作區(qū)域的特殊配置包括：
（1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)：2～8℃冰箱、漩渦震蕩器、超凈工作臺。
（2）標(biāo)本制備：2～8℃冰箱、-20℃冰箱、高速臺式冷凍離心機(jī)、漩渦震蕩器、金屬加熱模塊、超凈工作臺。
（3）擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)：熒光定量核酸擴(kuò)增儀、電腦、打印機(jī)。
同時：進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一向，并用明顯的箭頭表示，各區(qū)域用不同的顏色以示區(qū)別。即試劑貯存和設(shè)備區(qū)（藍(lán)色）→標(biāo)本制備區(qū)（白色）→擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)（粉色）。
四、如何分析室內(nèi)質(zhì)控品的結(jié)果？
采用Levey-Jerming質(zhì)控圖, 以X±2SD警告線，X±3SD為失控線。質(zhì)控點(diǎn)落在x±3S之外時，首先采取的措施是復(fù)檢，復(fù)檢的目的主要是用于查明人為誤差，也可以查出偶然誤差，如果是偶然誤差，重測的結(jié)果應(yīng)在允許范圍內(nèi)。同時還在觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成情況，擴(kuò)增效率的高低，曲線梯并是否良好，曲線形態(tài)是否標(biāo)準(zhǔn)，Ct值是否有飄移，還要結(jié)合臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果，是否有高值和低值，來區(qū)分是試劑造成的失控還是操作不當(dāng)、儀器故障或老化造成的失控。若臨床標(biāo)本測定結(jié)果的曲線標(biāo)準(zhǔn)，測量值有高有低，同時檢測的試劑空白及陰性質(zhì)控均在控，很有可能是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量有問題，如降解、更換試劑型號等情況發(fā)生造成的。 對于連續(xù)7個質(zhì)控點(diǎn)落在均值之一側(cè)，若均未超出X±3s范圍時，認(rèn)為存在系統(tǒng)誤差，但檢測結(jié)果仍可發(fā)出；若連續(xù)7個質(zhì)控點(diǎn)落在均值之一側(cè)，而且質(zhì)控數(shù)據(jù)有超出X±3s范圍的趨勢時(逐漸升高或逐漸降低)，一定要聯(lián)絡(luò)儀器工程師，及時校準(zhǔn)儀器。
五、內(nèi)標(biāo)定量與外標(biāo)定量對比？
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
內(nèi)標(biāo)定量：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，他們之間存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)，也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。
外標(biāo)定量：外標(biāo)法不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測樣品中，而是與被測樣品在相同條件下進(jìn)行檢測。由于在熒光定量PCR中，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，因此可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，并且在PCR循環(huán)剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期時，Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的結(jié)果也會準(zhǔn)確很多。
美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法?！綤e LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】
六、IU/ml和copies/ml之間單位換算關(guān)系？
首先簡單來說，IU/ml和copies/ml是沒有直接關(guān)系的，IU/ml是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的表述單位，copies/ml是各檢測方法對結(jié)果的表述單位的一種，可參見李金明《實(shí)時熒光PCR技術(shù)》P177。
所謂的International Unit（IU），是為了統(tǒng)一各個檢測方法而設(shè)定的單位。本身PCR檢測的拷貝數(shù)是無法定量的，可以理解為，為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，WHO制定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，賦予其IU值，發(fā)放給各個PCR試劑廠商，讓他們把各自檢測結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，從而得出各自的換算系數(shù)。比如分發(fā)的是1IU的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，羅氏測的是2copy，那羅氏的換算系數(shù)是2（2copies=1 IU），雅培的是20copy,那雅培的就是20（20copies=1 IU），由此可見，各個方法的轉(zhuǎn)換系數(shù)是不一樣的。
其次，因?yàn)楦鲗?shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果的表述單位存在多樣化，如copies/ml，geq/ml等，使得檢測結(jié)果沒有可比性，因而WHO應(yīng)用單位IU作為統(tǒng)一的表述單位，使不同實(shí)驗(yàn)室、不同檢測方法得出的檢測結(jié)果的表述單位得到統(tǒng)一并具有了可比性。
后，具體每種方法的檢測結(jié)果與IU的關(guān)系，可以通過同時檢測WHO的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后根據(jù)其與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比例關(guān)系，來找到不同檢測方法IU與copies之間的關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)篇
一、“假陰性”與“假陽性”結(jié)果如何判定？
假陰性判斷：造成假陰性結(jié)果的原因有很多，主要體現(xiàn)在FAM擴(kuò)增曲線不起來，原因包括標(biāo)本抑制，核酸提取失敗，基因突變以及儀器故障等。
目前國內(nèi)主流PCR試劑都不帶內(nèi)標(biāo)監(jiān)控功能，用于檢測目標(biāo)基因的FAM擴(kuò)增曲線既用來定量又用于定性（判斷陰陽性），因此FAM擴(kuò)增曲線的好壞非常關(guān)鍵。對于此類無內(nèi)標(biāo)試劑，建議結(jié)合乙肝血清標(biāo)志物結(jié)果（五項(xiàng)定量/定性結(jié)果）來判斷陰陽性，即使是FAM曲線有擴(kuò)增也應(yīng)該參考此結(jié)果，特別是E抗原結(jié)果。同時，對于擁有競爭性內(nèi)標(biāo)監(jiān)控功能的試劑來說，可有以下四種情況發(fā)生：如FAM無擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)有擴(kuò)增：結(jié)果正常，判斷該樣本為陰性結(jié)果；如FAM無擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)也無擴(kuò)增：結(jié)果異常，可能原因核酸提取失敗或有抑制，一定要重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如FAM有擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)有擴(kuò)增：結(jié)果正常，因?yàn)榇郎y核酸和內(nèi)標(biāo)在同一反應(yīng)體系下擴(kuò)增；如FAM有擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)無擴(kuò)增：結(jié)果正常，強(qiáng)陽性樣本會抑制內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增，導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)結(jié)果偏弱或陰性。
假陽性判斷（如何判定）：臨床PCR檢測當(dāng)中造成假陽性結(jié)果的情況比較少，原因包括試劑污染，氣溶膠污染，操作污染，擴(kuò)增產(chǎn)物污染，非特異性擴(kuò)增，耗材污染等，所以建議一定要做陰性對照來監(jiān)控是否存在污染。
二、造成陽性樣本漏檢的可能原因有哪些？
在臨床PCR檢測中，造成陽性樣本漏檢的原因很多，其中包括實(shí)驗(yàn)操作原因，試劑盒本身的原因，樣本原因等等。一：在實(shí)驗(yàn)操作過程中，核酸提取丟失或失敗而導(dǎo)致漏檢是比較常見的原因之一，如煮沸法試劑，要經(jīng)過高速離心、吸去上清及高溫煮沸等過程，很容易造成核酸的丟失，對于一些弱陽性樣本，很可能因核酸丟失造成漏檢；第二：由于試劑盒本身設(shè)計的缺陷，而導(dǎo)致對某種少見基因型檢測不出來情況，這是試劑盒設(shè)計的硬傷，因此檢驗(yàn)者必須根據(jù)具體情況來選擇合適的試劑進(jìn)行檢測；第三：操作過程中，因操作不規(guī)范，帶入一些外源性抑制物，而終導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增受抑制。可見試劑盒方法學(xué)特點(diǎn)以及去抑制物能力對臨床檢驗(yàn)的重要性。另外，一些外源性抑制物也有可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，比如手套的滑石粉，因此建議使用無粉手套，同時也要求操作者嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作。
三、PCR擴(kuò)增曲線中，造成不規(guī)則擴(kuò)增曲線的可能原因有哪些？
實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線包括基線期，指數(shù)擴(kuò)增期，線性擴(kuò)增期和擴(kuò)增平臺期，標(biāo)準(zhǔn)的曲線應(yīng)該呈典型的S型。
不規(guī)則曲線可以根據(jù)曲線的具體情況來分析：
1）曲線呈斜線上升
原因：熱蓋失靈或熱蓋沒蓋緊，導(dǎo)致控溫不準(zhǔn)、液體揮發(fā)。
解決辦法:更換儀器熱蓋或?qū)嵘w蓋緊。
圖1 曲線呈斜線上升
2）擴(kuò)增曲線分成兩段（斷裂）
圖2擴(kuò)增曲線分成兩段（斷裂）
原因：基線的終點(diǎn)大于Ct值，通常是因?yàn)槟０錎NA濃度偏高，CT值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分?jǐn)U增信號，導(dǎo)致曲線被壓下去。
解決方法：減小基線終點(diǎn)，至Ct值前4個循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。
3）直線擴(kuò)增曲線
圖3 某些樣本出現(xiàn)直線擴(kuò)增曲線
原因：探針部分降解
解決辦法:建議更換試劑進(jìn)行測試。
4）曲線平臺期下掉
原因：蓋子沒蓋緊
解決辦法:PCR反應(yīng)管蓋子蓋上后，檢查蓋子是否蓋緊。
圖4 曲線平臺期下掉
四、乙肝兩對半的大三陽標(biāo)本HBV DNA檢不出怎么辦？
HBV-DNA檢查是反應(yīng)乙肝病毒復(fù)制程度和傳染性大小的直接指標(biāo)。臨床數(shù)據(jù)顯示，在乙肝兩對半大三陽病例 中，HBV DNA陽性的檢出率*，但HBV DNA陰性的結(jié)果也是很有可能的。一般乙肝大三陽HBV-DNA陰性雖然表明患者病毒未超標(biāo)，但大三陽結(jié)果提示患者感染乙肝病毒，且具有較強(qiáng)傳染性。盡管如此，臨床檢驗(yàn)者也可能遇到大三陽標(biāo)本HBV DNA檢測不出的情況。首先對于這樣的標(biāo)本，可以將標(biāo)本進(jìn)行稀釋后進(jìn)行復(fù)查，排除血清或血漿標(biāo)本中存在抑制物或者陽性標(biāo)本HBV DNA濃度超過試劑盒上限而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗的情況。其次，乙肝病毒發(fā)生變異也是導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不出的原因之一，通常都是用藥治療患者的乙肝病毒核酸序列發(fā)生了突變。如經(jīng)過多種PCR試劑檢測失敗后，可進(jìn)行DNA測序以確定乙肝病毒及其變異位點(diǎn)，以指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥治療。后， 可更換另一廠家試劑進(jìn)行檢測，排除原試劑本身設(shè)計缺陷而造成漏檢的情況。
五、乙肝兩對半全陰的標(biāo)本HBV DNA結(jié)果呈陽性怎么辦？
國內(nèi)外文獻(xiàn)報道證實(shí)，乙肝兩對半標(biāo)志物全陰性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因?yàn)镠BV DNA的檢測窗口期出現(xiàn)早于乙肝血清標(biāo)志物，因此此類患者可能處于乙肝感染早期。
乙肝感染后，在乙肝“兩對半”檢測中，表面抗原HBsAg出現(xiàn)早，一般在感染3周后出現(xiàn)，而HBV DNA的檢測能將窗口期縮短至6-15天，乙肝兩對半全陰的標(biāo)本HBV DNA為陽性，是因?yàn)椴∪颂幱诟腥疽腋尾《镜某跗?，免疫學(xué)的檢測窗口期比基因檢測的窗口期長，導(dǎo)致兩對半檢測結(jié)果為陰性，由此可知：HBV DNA的檢測，對于疾病的早期診斷有著非常重要的意義。
六、怎樣保證實(shí)驗(yàn)室的檢測質(zhì)量？
1）為了保證檢測質(zhì)量，臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間，良好的照明和空調(diào)設(shè)備。工作環(huán)境雖不是檢測質(zhì)量的直接原因，但寬敞舒適的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境將肯定有利于檢驗(yàn)質(zhì)量的保證。
2）合理有效地對儀器設(shè)備進(jìn)行管理，定期做維護(hù)和校準(zhǔn)，使其處于一個良好的狀態(tài)。例如，定期校準(zhǔn)移液器，使其保持足夠的準(zhǔn)確度和精密度。定期維護(hù)熒光定量PCR儀的光學(xué)系統(tǒng)和反應(yīng)孔間溫度差異，使其保持在良好狀態(tài)和允許的范圍內(nèi)。此外，還包括天平，離心機(jī)，冰箱等設(shè)備的管理。
3）理想的試劑：主要有內(nèi)外兩個因素，內(nèi)在因素包括標(biāo)本處理方法，用于核酸擴(kuò)增的原材料及方法學(xué)設(shè)計等。外出因素包括試劑盒的運(yùn)輸和保存中的問題。
4）標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：完整的臨床PCR程序由標(biāo)本采集，運(yùn)送，保存，編號，試劑準(zhǔn)備，核酸提取，擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測，結(jié)果分析和報告等諸多環(huán)節(jié)，建立科學(xué)和與本實(shí)驗(yàn)室配套的SOP文件，嚴(yán)格按SOP進(jìn)行操作。
5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有標(biāo)本中的大量待測微生物，克隆質(zhì)粒，大量存在實(shí)驗(yàn)室中的特定微生物以及以前擴(kuò)增產(chǎn)物的殘留污染等。這些都是實(shí)驗(yàn)室容易造成假陽性的污染。因此，必須嚴(yán)格分區(qū)實(shí)驗(yàn)室及遵守工作流程，使用化學(xué)清潔實(shí)驗(yàn)臺面，使用紫外線照射和UNG方法消除擴(kuò)增產(chǎn)物污染等等。
6）進(jìn)行室內(nèi)和室間質(zhì)量控制，室內(nèi)質(zhì)量控制可以確保實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)測定質(zhì)量的一致性，室間質(zhì)量控制可以提供將實(shí)驗(yàn)室測定情況與一室間和客觀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回顧性比較的數(shù)據(jù)。
七、實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物污染怎么辦？
答：如實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露，造成實(shí)驗(yàn)室的污染，那么后果將非常嚴(yán)重。要去除污染，首先重要的是保持通風(fēng)，保證擴(kuò)增產(chǎn)物片段能順利擴(kuò)散出去；其次可采用稀酸處理法，對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大；后若污染長時間不能消除，建議更換另外廠家的PCR試劑進(jìn)行檢測，因?yàn)槊總€廠家的引物設(shè)計區(qū)域不一樣；一般情況下，一家試劑公司的擴(kuò)增產(chǎn)物不會在另外一家廠家的引物設(shè)計區(qū)域內(nèi)，因此不會造成產(chǎn)物污染的假陽性。
儀器篇
一、如何判斷自己的PCR儀器熒光檢測是否正常？
要判斷自己的PCR儀器是否正常，可從以下幾方面考慮：
1.儀器開關(guān)機(jī)，與軟件連接是否正常。
2.儀器運(yùn)行同樣的實(shí)驗(yàn)所需要的時間是否跟平時一致，由此判斷儀器的加熱制冷模塊是否正常。
3.曲線結(jié)果是否呈明顯的S型，若曲線異常，如呈曲折上升狀，則可能是熱蓋問題，或者是熒光檢測裝置出現(xiàn)問題。
4.若曲線的熒光值與平時相比，明顯降低，則要考慮是否需要更換儀器光源（尤其是鹵素?zé)?，其光源壽命約2000h）。
5.若儀器某一孔或幾孔的熒光值明顯高于其他孔位，則需要考慮儀器的孔槽或檢測光路是否受到熒光污染，建議清洗儀器孔槽后再進(jìn)行測試。
二、PCR儀器運(yùn)行中突然斷電怎么辦？
答：通常我們建議在實(shí)驗(yàn)室配備UPS電源，這樣能夠保證PCR儀器運(yùn)行過程中的正常供電，從而保證程序的正常運(yùn)行。PCR儀器在運(yùn)行中突然斷電的話，如儀器有斷電保護(hù)功能，則可直接繼續(xù)運(yùn)行程序。如實(shí)驗(yàn)室無UPS電源，突然斷電而導(dǎo)致PCR程序不能完成，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，建議只能重復(fù)實(shí)驗(yàn)再上機(jī)檢測。
三、PCR儀器的熱蓋壞了怎么辦？
答：熒光定量PCR儀的熱蓋失效或故障主要的表現(xiàn)是：控溫不準(zhǔn)和液體揮發(fā)，反應(yīng)液揮發(fā)會終導(dǎo)致曲線不擴(kuò)增，呈斜線上升。首先可通過曲線判斷熱蓋是否故障，若確定熱蓋已經(jīng)壞了，建議可以在每個PCR反應(yīng)管中加入一層礦物油（礦物油可避免反應(yīng)液揮發(fā)），上機(jī)測試曲線結(jié)果是否正常。如曲線仍然異常，則建議請儀器工程師現(xiàn)場維修，甚至直接更換熱蓋。
四、PCR儀器有哪些常見的小問題？如何解決？
答：PCR儀器常見的小問題有如下幾點(diǎn)：
1.打開電源但是儀器不響應(yīng)。這種情況很可能是由于電源線脫落或者沒有插緊而致，將電源線重新插入插座即可排除故障。
2.儀器和軟件無法正常連接。建議打開儀器電源，讓儀器通過自檢后，再打開軟件；因?yàn)閮x器在自檢過程中，很容易導(dǎo)致軟件連接不上。另外，若儀器和軟件仍連接不上，檢查連接線是否插緊，再重啟軟件。
3.儀器加熱或冷卻速度緩慢。PCR反應(yīng)過程的關(guān)鍵是升、降溫過程的時間控制，要求越短越好，當(dāng)PCR儀的降溫過程超過60s，就應(yīng)該檢查儀器的制冷系統(tǒng)，對風(fēng)冷制冷的PCR儀要較*地清理反應(yīng)底座的灰塵；對其他制冷系統(tǒng)應(yīng)檢查相關(guān)的制冷部件，找儀器工程師進(jìn)行維護(hù)。
4.熱蓋控溫失靈。這種情況可能會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的曲線結(jié)果很亂，不呈S型，且運(yùn)行結(jié)束后，會發(fā)現(xiàn)PCR反應(yīng)管的側(cè)壁甚至頂部有很多液滴，這樣會導(dǎo)致熒光采集光路發(fā)生變化，曲線結(jié)果異常。
5.儀器加熱模塊的孔槽被污染，導(dǎo)致一個或多個孔的熒光值很高。結(jié)果運(yùn)行完成后，發(fā)現(xiàn)某個孔位的熒光值本底明顯高于其他孔位，則要考慮該孔是否被污染，對儀器孔槽進(jìn)行清潔。先打開蓋子，然后用無水乙醇浸泡樣品池5min，然后用移液器吸去液體，再加入去離子水進(jìn)行二次清潔，用移液器吸去液體；打開PCR儀，設(shè)定保持溫度為50℃的PCR程序并使之運(yùn)行，讓殘余液體揮發(fā)去除，一般5～10min即可。
五、PCR反應(yīng)管上面做標(biāo)記對結(jié)果有何影響？
答：我們不建議在PCR反應(yīng)管上用記號筆做任何標(biāo)記。據(jù)李金明教授的《實(shí)時熒光PCR技術(shù)》一書上的P100記載：反應(yīng)管用記號筆做標(biāo)記，加熱將使顏料揮發(fā)，進(jìn)而污染光路部分影響檢測。
六、PCR反應(yīng)管為什么不放在儀器孔槽的邊緣？
答：主要原因大致分為一下兩點(diǎn)：
①CCD檢測系統(tǒng)：對于采用CCD檢測系統(tǒng)而不是PMT或者其他檢測系統(tǒng)的熒光定量PCR儀器來說，由于曝光和成像原理，使得采集到的信號中間強(qiáng)，兩邊弱，即我們常說的邊緣效應(yīng)，因此對于此系統(tǒng)，將反應(yīng)管放在儀器中間是比較好的；
②對于采用熱蓋加熱或保溫的儀器，如果PCR管單獨(dú)放在儀器孔槽的一邊，容易讓熱蓋傾斜，也會對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生細(xì)微的影響，因此放中間也好些。
雅吉生物篇
一、雅吉生物HBV一步法操作過程有什么需要注意的地方？
答：操作雅吉生物HBV一步法主要有如下需要注意的地方：
1.使用校準(zhǔn)過的移液槍，建議取核酸釋放劑和樣本的移液器量程大為10ul，加反應(yīng)液的移液器量程大為100ul。
2.加核酸釋放劑可以使用一個移液槍頭，建議采用深吸淺打的連續(xù)加樣方式（具體操作方式見后圖說明）。
3.標(biāo)準(zhǔn)品和樣本使用前先混勻并瞬時離心，加標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品的時候，加一個樣換一個槍頭，建議槍頭伸到底部吹打3次，力度均勻避免產(chǎn)生氣泡。
4.加完標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品并吹打三次后，建議等待10分鐘后再加反應(yīng)液，如一次做的標(biāo)本量在32個以上則不需要等待。
5.加反應(yīng)液的時候，加一個樣本換一個移液槍頭，避免污染！槍頭需伸入到八連管內(nèi)部靠壁加入，不要懸空加。
6.樣本和反應(yīng)液都可以采用淺吸深打的加樣方式（具體操作方式見后圖說明）。
7.加完反應(yīng)液后，無需等待，蓋上蓋子，即可上機(jī)。
移液器的兩個檔位：1檔、2檔
a.核酸釋放劑深吸淺打：調(diào)節(jié)移液器至5ul，吸液時按到2檔，伸入核酸釋放劑的試劑管中，松開移液器，即取到液體。將核酸釋放劑加入八連管中時，按到1檔打出去，此時打出去的液體剛好為5ul。手不要松開，此時槍頭中還剩下一部分液體，再將此槍頭伸入試劑管中松開，即第二次取液，按1檔將液體打入八連管，如此下去將核酸釋放劑均加入八連管。到后一個孔時還剩余小部分核酸釋放劑，可以舍棄掉，如確定沒有被污染，可以打回試劑管中。
b.樣本和反應(yīng)液淺吸深打：即常規(guī)的加液方式，加樣本時，調(diào)節(jié)移液器至5ul（若是反應(yīng)液則是40ul），吸液時按到1檔，伸入試劑管中，松開移液器，取到液體。將試劑加入八連管中時，按到2檔*將液體打出去。換一個槍頭加其他的樣本或試劑。
二、HBV一步法加5ul樣本是否太少了？
答：傳統(tǒng)的煮沸法過程是：取100ul血清樣本與100ul處理液A，經(jīng)高速離心、濃縮去上清后，加入25ul處理液B，后取2μl DNA提取物上樣；通過反推法，煮沸法相當(dāng)于取了8μl原始樣本。我們綜合考慮煮沸法的提取過程，首先，在高速離心濃縮病毒時，對于高濃度的樣本，病毒沉淀不*，容易造成一次核酸丟失；其次，在去除上清液的過程中，因?yàn)槲覀儫o法清楚地看到離心管中的沉淀，槍頭極有可能碰到底部的病毒，導(dǎo)致帶出病毒，造成核酸的第二次丟失；再次，在高溫加熱煮沸過程中，蛋白質(zhì)高溫變性，成為凝膠狀，可能導(dǎo)致在第三步的高速離心中，凝膠狀的蛋白包裹核酸，沉降到離心管底部，造成核酸的第三次丟失。綜合可知：煮沸法的8ul上樣量是不準(zhǔn)確、不真實(shí)的。
反觀一步法，其原理是取5ul核酸釋放劑和5ul血清，直接加到PCR反應(yīng)管中，病毒裂解，核酸釋放出來。核酸釋放劑的裂解作用非常強(qiáng)烈，能夠使核酸*釋放出來，核酸無需進(jìn)行提取，沒有損失，5ul血清中的病毒全部進(jìn)入擴(kuò)增，保證了定量的準(zhǔn)確性。
三、磁珠法的原理是什么？
磁珠法是采用納米磁珠提取血清或血漿樣品經(jīng)裂解后釋放出的的核酸，利用針對核酸保守區(qū)設(shè)計的一對特異性引物、一條特異熒光探針，配以PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實(shí)現(xiàn)核酸的定量檢測。簡單步驟：加溶液1→加樣本→加溶液2→棄廢液→加溶液3和4→棄廢液→加反應(yīng)液上機(jī)。核酸提取溶液1含十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100、異硫氰酸胍等主要是裂解、釋放核酸的作用；核酸提取溶液2內(nèi)含磁珠顆粒，磁珠經(jīng)過特殊的修飾，能夠特異性吸附核酸。溶液3主要是無機(jī)溶液，主要是清洗吸附了核酸的磁珠，去除雜質(zhì)。溶液4為礦物油，能夠去除能溶于有機(jī)相的雜質(zhì)，同時，在去除廢液時，能更好的排除溶液3對擴(kuò)增的影響。
四、ROX校正有何作用？
答：通常我們在進(jìn)行PCR的操作時，無法保證每個樣本的加樣量是*一致的，每個樣本之間都會有細(xì)微的差別，同時，因?yàn)閮x器的溫控和光源系統(tǒng)都會存在不同程度的邊緣效應(yīng)，導(dǎo)致模塊的每個孔間都存在差異。反應(yīng)液中ROX的濃度是固定的，因此其信號的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)，因此ROX可用于消除用槍操作誤差、耗材PCR反應(yīng)管的管蓋、管壁的厚度差異，同時可校正儀器的孔間溫差以及光源的邊緣效應(yīng)造成的光學(xué)誤差，減少孔間差異，提高數(shù)據(jù)重現(xiàn)性和度，使定量更準(zhǔn)確。