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細(xì)胞表面標(biāo)記的檢測技術(shù)活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)－流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備
閱讀：297 發(fā)布時間：2019-9-16實(shí)驗(yàn)方法原理 活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測定的熒光強(qiáng)度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。
實(shí)驗(yàn)材料 抗體血清
試劑、試劑盒 RPMI1640DPBS洗滌液固定液
儀器、耗材 玻璃管塑料管離心機(jī)顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備活性高的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法）
2. 用10 ％FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106～1×107 /ml
3. 取40 μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料離心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀釋）滅活正常兔血清，4 ℃ 30 min
4. 用洗滌液洗滌2 次，每次加洗滌液2 ml左右，1000 rpm×5 min
5. 棄上清，加入50 μl工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標(biāo)記物，充分振搖，4 ℃ 30 min
6. 用洗滌液洗滌2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min
7. 加適量固定液（如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1 ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100～500 μl固定液）
8. FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察（標(biāo)本在試管中可保存5～7 天）
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注意事項(xiàng)
1. 整個操作在4 ℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN3，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。
2. 洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。
3. 加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。
4. 細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。
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其他
一、附錄
1. DPBS （×10， 貯存液）
NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸餾水加至1000 ml，Na2HPO4 11.5 g，臨用時用蒸餾水1∶10稀釋，KH2PO4 2 g
2. 洗滌液
DPBS 900 ml，F(xiàn)CS 50 ml（終濃度5 ％），4 ％ NaN3 50 ml（終濃度0.2 ％）
3. 固定液
DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（終濃度2 ％），甲醛 10 ml，NaN3 0.2 g （終濃度0.02 ％）