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小鼠線粒體 DNA 探針?lè)晒舛?PCR 試劑盒
閱讀：544 發(fā)布時(shí)間：2019-9-9產(chǎn)品及特點(diǎn) 線粒體是真核生物產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器，它具有自身的基因組，線粒體 DNA 和
細(xì)胞核 DNA 共同決定真核生物的表現(xiàn)型，因此研究線粒體 DNA 具有重要的意義。
本試劑盒基于熒光定量 PCR 原理開(kāi)發(fā)，可用于定量分析小鼠線粒體 DNA。它具有下
列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 根據(jù)小鼠線粒體 DNA 保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專(zhuān)一性地檢測(cè)出樣品中的小鼠
線粒體 DNA 成分，但不能檢測(cè)其他非小鼠線粒體 DNA 成分。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5. 快速，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅為 2.0 小時(shí)。
6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針?lè)晒舛?PCR。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 十孔盒包裝
2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL（本色蓋）
熒光 PCR 模板稀釋液 180701 1 mL（黃蓋）
小鼠線粒體 DNA 探針?lè)?qPCR 引物混合
液
15-141yw 100 uL（白蓋）
小鼠線粒體 DNA qPCR 探針 15-141pb 50 uL（棕色管）
小鼠線粒體 DNA 探針?lè)?qPCR 陽(yáng)性對(duì)照
（1×10E8 拷貝/uL）
60908-
141pc
50 uL（黃蓋）
天凈沙核酸釋放劑試用裝 61202 20 次（1mL，綠蓋）
使用手冊(cè) 15-141sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，由于其濃度較
高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專(zhuān)門(mén)的區(qū)域操作。
自備試劑 DNA 模板
使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)
準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本
試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分
震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)
照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。如果用本試劑盒自帶的天凈沙核酸釋放劑
試用裝
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上
步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲
線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)
用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于
PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用步稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列稀釋液的第 4 號(hào)做模板）。下
面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：
成分
樣品管
N+2 個(gè)
PCR 陰性
對(duì)照管
標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
小鼠線粒體 DNA 探針?lè)?qPCR
探針 1 μL 1 μL 各 1 μL
小鼠線粒體 DNA 探針?lè)?qPCR
引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 個(gè)待測(cè)樣品 DNA 模板 7 μL 不加 不加
超純水 不加 7 μL 不加
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液
（2-7 號(hào)）
不加 不加
各 7μL（2 號(hào)樣到 2
號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)
管…）
四、qPCR 反應(yīng)參數(shù)
過(guò)程 溫度 時(shí)間
預(yù)熱 50℃ 2 min
預(yù)變性 95℃ 10 min
PCR 反應(yīng)
（50 個(gè)循環(huán)）
95℃ 15sec
60℃ 1min（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)）
五、數(shù)據(jù)處理
11. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱
軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的
log 值，再推算出其濃度。
12. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等
于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于
30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為
陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則
為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。
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