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產品及特點

人皰疹病毒8型（Human Herpesvirus-8，HHV-8) 會引起人類的原發(fā)和繼發(fā)感染，原發(fā)感染在兒童中多見，水痘的出疹突發(fā)，常出現(xiàn)紅色皮疹或斑疹，繼續(xù)發(fā)展為成串水皰、膿皰，后結痂。病情一般較輕，但偶可并發(fā)間質性肺炎和感染后腦炎。該病毒對人體健康造成嚴重損害，因此快速檢測人皰疹病毒8型具有重要意義。為此本公司開發(fā)了簡單快捷的人皰疹病毒8型染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

• 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
• 根據(jù)人皰疹病毒8型保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
• 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
• 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
• 本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。
• 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

規(guī)格及成分

運輸及保存

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

DNA模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。

使用方法

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

• 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
• 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
• 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
• 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
• 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
• 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
• 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

• 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
• 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送20次免核酸提取的天凈沙核酸釋放劑，其使用手冊可從

三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

• 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液，濃度為10000拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。
• 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

• 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

• 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

• 數(shù)據(jù)處理

• 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
• 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

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