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建立一個實時 PCR 定量分析實驗
閱讀：582 發(fā)布時間：2019-5-10對于一個新的靶分子建立實時 PCR 定量分析的過程包括：①設(shè)計步驟一 PCR 引物和探針的選擇；②根據(jù)特定分析的要求，選擇實時 PCR 的檢測方法。使用 SYBRGreen 的實時 PCR 通常被用于優(yōu)化引物，且被主要用于在研究中檢測 PCR 產(chǎn)物 TaqMari 探針和分子信號提供了更好的特異性。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉試劑、試劑盒 MgCl2探針HotStmMix正向和反向擴增引物模板 DNA
儀器、耗材 PCR 儀反應(yīng)管、毛細管或 96 孔的微量滴定板
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
MgCl2(25 mmol/L)
探針（例如分子信號）或 SYBRGreen(MolecularProbes)
2. 酶和酶緩沖液
HotStmMix，2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 緩沖液和 dNTP)
3. 核酸和寡核苷酸
正向和反向擴增引物
模板 DNA
4. 設(shè)備
實時 PCR 儀
合適的反應(yīng)管、毛細管或 96 孔的微量滴定板（按照不同的方法選用）
二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER
1.在 96 孔的微量滴定板上為每個反應(yīng)集中如下的 PCR 組分?；旌?HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。
2XHotStartMix 25ul
引物 A 0.1~ 0.5umol/L
引物 B 0.1~ 0.5umol/L
探針或 SYBRGreen 0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 10ul
水 補滿到 50ul
2.使用兩步（所有的 ABI7700TaqMan 定量分析）或三步 PCR。對于三步 PCR, 利用如下條件運行 40~50 個循環(huán)進行擴增。
對于兩步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火溫度到 60°C。
*取決于 HotStart 程序。
3.繼續(xù)進行下文步驟④的優(yōu)化方案。
三、方法 B—SMARTCYCLER
1.在適當?shù)墓苤袨槊總€反應(yīng)集中如下的 PCR 組分?；旌?HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。
2XHotStartMix 2.5ul
引物 A 0.3~0.8umol/L
引物 B 0.3~0.8umol/L
探針或 SYBRGreen 0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 5ul
水 補滿到 25ul
Smartcycler 要求使用的管子。
2.利用兩步或三步 PCR。對于三步 PCR，利用如下條件運行 40 個循環(huán)進行擴增。
對于兩步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火溫度到 60°C。
*取決于 HotStart 程序。
3.繼續(xù)進行下文步驟4的優(yōu)化方案。
四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR
1.在適當?shù)墓苤袨槊總€反應(yīng)集中如下的 PCR 組分?；旌?HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。
2XFastStartMix 10ul
引物 A 0.1~0.5umol/L
引物 B 0.1~0.5umol/L
探針或 SYBRGreen* 0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 5ul
水 補滿到 20ul
*LightCycler 要求使用毛細管。
2.利用三步 PCR, 如下條件運行 40(原文為 45—譯者改）個循環(huán)進行擴增。
3.繼續(xù)進行下文步驟④的優(yōu)化方案。
優(yōu)化定置分析的實用方法（見 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)
4.為了優(yōu)化擴增子和引物，利用解鏈曲線功能分析實時 PCR 產(chǎn)物，此功能在 ABI770上不能直接獲得。對單個產(chǎn)物而言，結(jié)果應(yīng)顯示其具有一個特異的解鏈峰，沒有表明形成引物二聚體的次級烽。當解鏈曲線數(shù)據(jù)以一階導(dǎo)數(shù)表示時將會是一單峰。多個峰表明有其他的擴增產(chǎn)物存在。如果檢測到多個峰，說明可能需要進一步優(yōu)化鎂離子的濃度，但通常這表明需要重新設(shè)計引物。
5.為了優(yōu)化探針，可利用靶分子的 1 倍稀釋液，選擇任意單位作標準曲線。例如假定DNA 的高濃度值是 107，由此它的 10 倍稀釋系列分別定為 107、106、105、104、103。鍵入這些數(shù)值作為起始量，在定量分析結(jié)束時用軟件作標準曲線。利用循環(huán)閾（Ct) 值和DNA 的起始濃度將可計算反應(yīng)效率。
6.與常規(guī) PCR 相似，需用一系列按 10 倍稀釋的標準液做進一步反應(yīng)，以優(yōu)化 MgCl2的濃度、引物濃度、探針濃度、退火溫度，以及調(diào)整 PCR 方案。
7.對于本身沒有快速循環(huán)操作方案的體系，可以嘗試進行更短的循環(huán)方案，以減少定量分析的時間。