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大鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞培養(yǎng)實驗
閱讀：1083 發(fā)布時間：2019-4-24實驗方法原理 SD胎鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d ，微量移液器塑料滴頭于培養(yǎng)孔內機械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)元，依劃割程度不同分為輕、中、重3組，對照組除不進行機械性劃割，其余處理同損傷組，傷后不同時間點（10，30 min ， 1，3，6，12，24 h）檢測細胞存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量。
實驗材料 SD大鼠
試劑、試劑盒 硼酸硼砂緩沖液胰酶-EDTA 消化液D-Hanks’
儀器、耗材 眼科剪滴管離心機培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
實驗步驟
一、實驗步驟
1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks’平衡鹽液中。
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內消化20 min，中間搖晃一次。
3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內終止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟 2～3 次。
5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。
6. 過濾后的細胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細胞懸液。
7. 細胞計數(shù)，調整細胞密度按1.5x105/cm2 種入6 孔板內，放入CO2 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。
收起
注意事項
1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進行消化，有人還直接進行吹打，都可行。
2. 上面雖然時大鼠皮層神經(jīng)元，但是同樣適用于小鼠，但是應該選擇孕13 d 左右的小鼠。
3. 神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細胞，因此在接種時細胞的密度一定要夠。
4. 在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經(jīng)細胞的影響 是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養(yǎng)中還是用同 一來源(廠家)的玻片。
5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基，那么就方便了(不用加 AraC):
(1)把細胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 半量換液。
(2)把細胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種。
(3)可以用新生1 d 內的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。
酶消化法
實驗材料 小鼠
試劑、試劑盒 酒精解剖液胰蛋白酶DMEM F12B27阿糖胞苷培養(yǎng)液
儀器、耗材 培養(yǎng)箱
實驗步驟
一、小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟
1. 于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠腦。
2. 預冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質漂洗，用眼科剪將皮質反復剪切成碎塊。
3. 移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培養(yǎng)箱中消化30 min。
4. 將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液。
5. 后再用接種液1 ml混懸，反復吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用。
6. 加入1ml接種液后再次吹打，如此反復3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去終殘塊。
7. 收集含單細胞懸液的上清液約4-5 ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液重新懸浮細胞，細胞記數(shù)；接種1x107個細胞于6孔培養(yǎng)板中。
8. 培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27）培養(yǎng)3d，觀察神經(jīng)元生長狀況。
9. 換用阿糖胞苷培養(yǎng)液、 每隔3d換全培養(yǎng)液1次，每次換半液。
二、神經(jīng)元免疫化學鑒定
1. 4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗滌3次。
2. 加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min，PBS洗滌3次。
3. 加入5%羊血清封閉20 min，棄去多余液體。
4. 加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經(jīng)元特異性烯醇化酶），培養(yǎng)箱中孵育2-4 h，PBS洗滌3次。
6. 加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min；PBS洗滌3次。
7. 熒光顯微鏡觀察。
三、結果
圖1： 剛接種時細胞圖
圖2： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)1d后
圖3： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)2d后
圖4： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)3d后
圖5： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)4d后
圖6： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)5d后
圖7： 剛接種時細胞圖培養(yǎng)6d后
圖8：第7d免疫鑒定圖