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細(xì)胞凋亡檢測實驗之TUNEL 法
閱讀：1010 發(fā)布時間：2019-3-19實驗方法原理 細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA 雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA 的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。
TUNEL 實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。
Caspase-3 活性的檢測
實驗方法原理 Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用， 其中caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3 由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3 的活性明顯下降。
實驗步驟
一、Western blot 分析Procaspase-3 的活化，以及活化的Caspase-3 及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集細(xì)胞→PBS 洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 電泳→硝酸纖維素膜或PVDF 膜轉(zhuǎn)移→5 %脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h 或4 °C 過夜→Caspase-3 多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2 h 或4 °C 過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3 次，5~10 min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG 或AP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2 h→ TBS-T 洗3 次， 5~10 min/次→ECL 顯影或NBT/BCIP 顯色。
二、熒光分光光度計分析
1. 原理：活化的Caspase-3 能夠特異切割D1E2V3D4-X 底物，水解D4-X 肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC 才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC 熒光強(qiáng)度的大小，可以測定caspase-3 的活性，從而反映Caspase-3 被活化的程度。
2. 方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞，PBS 洗滌，制備細(xì)胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3 四肽熒光底物），37 °C 反應(yīng)1 h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長380 nm，發(fā)射光波長為430-460 nm）。
三、流式細(xì)胞術(shù)分析
方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞，PBS 洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37 °C 反應(yīng)1 hUV 流式細(xì)胞計分析caspase-3 陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。