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小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：630 發(fā)布時(shí)間：2019-2-26實(shí)驗(yàn)方法原理 取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與乳膠顆粒在不同培養(yǎng)條件下混合后定量加入24孔板，37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
實(shí)驗(yàn)材料 小鼠
試劑、試劑盒 1640 培養(yǎng)基小牛血清雙抗臺(tái)盼蘭
儀器、耗材 手術(shù)器械一次性注射器眼科鑷眼科剪96 孔板CO2培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 如果采用刺激物，則可在實(shí)驗(yàn)前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。
2. 拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2 分鐘，移入超凈臺(tái)中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。
3. 用注射器抽取5mL 含雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個(gè)小口，用吸管吸取細(xì)胞懸液，移入離心管中(個(gè)人認(rèn)為，此法比用注射器抽吸好一些)。
4. 1000 rpm 離心5 min 后，用含雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細(xì)胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋到目的濃度后，接種即可。
5. 如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，調(diào)整濃度至2x105個(gè)/mL，接種到96 孔板中，每孔100-200μL；如 果作為其它實(shí)驗(yàn)使用，可以調(diào)整成2x106/mL，加到 24 孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO2溫箱孵育2 h 后， 換液，并用RPMI 1640 培養(yǎng)基洗1-2 次，棄去未粘附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。
二、結(jié)果
巨噬細(xì)胞剛貼壁時(shí)偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性，當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時(shí)候，在40 倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，因此，巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。
收起
注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格無菌操作，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行；
2. 為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器；
3. 吸管吸取細(xì)胞懸液的時(shí)候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細(xì)胞污染。
其他
巨噬細(xì)胞一般沒有特殊的鑒定方法，有兩條經(jīng)驗(yàn)：
1. 巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不會(huì)增殖
2. 很難消化下來，所以接種的時(shí)候，必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。