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技術(shù)文章

流式抗體選擇技巧系列Ⅰ——單色熒光標(biāo)記

閱讀:643          發(fā)布時(shí)間:2018-10-17

流式抗體選擇六步曲
特異性靶蛋白:確定要檢測(cè)目的細(xì)胞特異性靶蛋白。
種屬:嚴(yán)格按照待測(cè)樣本種屬選擇抗體。
應(yīng)用領(lǐng)域:可用于流式實(shí)驗(yàn),說(shuō)明書(shū)中明確標(biāo)注經(jīng)FCM實(shí)驗(yàn)測(cè)試,有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖和用量說(shuō)明;若還可做熒光染色等多用途則更佳。
抗體克隆號(hào):同一抗體多個(gè)克隆號(hào)的情況下,可以選擇熒光標(biāo)記種類(lèi)多的那個(gè)克??;若文獻(xiàn)中有被引用,首先選擇被引用的抗體克隆號(hào)。
盡量選擇直接標(biāo)記的抗體:直接標(biāo)記抗體是指熒光素標(biāo)記的單克隆或多克隆一抗,一步染色,操作方便,影響因素少,結(jié)果準(zhǔn)確。
同型對(duì)照:與一抗的來(lái)源,Ig分型和標(biāo)記*一致,使用時(shí)與一抗相同的濃度。

標(biāo)記方法的選擇——直標(biāo)or間標(biāo)(Biotin)根據(jù)抗原表達(dá)豐度來(lái)選擇:
直標(biāo)抗體(一步法):待測(cè)抗原表達(dá)豐度高的盡量選擇直標(biāo)抗體。
間標(biāo)抗體:待測(cè)抗原表達(dá)豐度低的要考慮選擇間接標(biāo)記抗體(無(wú)熒光一抗 + 熒光二抗——兩步法)或生物素標(biāo)記抗體(無(wú)熒光一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + 熒光標(biāo)記鏈霉親和素——三步法)。
熒光抗體的選擇:
1、確定流式細(xì)胞儀的參數(shù)配置
在設(shè)計(jì)流式方案前,根據(jù)可能需要同時(shí)檢測(cè)指標(biāo)的多少數(shù)量,先確定需要在哪臺(tái)流式細(xì)胞儀檢測(cè),對(duì)該儀器的參數(shù)配置,要了解以下幾個(gè)方面信息:
激光器:常見(jiàn)的流式細(xì)胞儀有355nm、488nm和640nm三個(gè)激光器,但有些機(jī)器在購(gòu)買(mǎi)時(shí)因某些原因,只裝了一個(gè)488nm激光器,所以需要注意型號(hào)相同的機(jī)器也未必激光配置相同。
濾光片:也就是有幾個(gè)檢測(cè)通道,這決定了你多可以同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)。
儀器的具體型號(hào):有助于再次確定檢測(cè)通道。因?yàn)橥粋€(gè)熒光在不同的流式細(xì)胞儀上檢測(cè),有時(shí)候檢測(cè)通道也是不一樣的。
流式細(xì)胞儀中常用的熒光染料光學(xué)特征以及需要的激光器

2、熒光的選擇建議
熒光本身有強(qiáng)弱之分,可視抗原表達(dá)強(qiáng)弱及分群情況選擇合適的熒光??乖磉_(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光例如:PE、APC;反之,抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC。
常用熒光強(qiáng)弱排序程度為:PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC。
類(lèi)似熒光的取代:Alexa Fluor、eFluor等這些熒光非常明亮,對(duì)激光穩(wěn)定性好,對(duì)PH 值不敏感,具有水溶性。如Alexa Fluor488與FITC檢測(cè)通道相同,但是熒光強(qiáng)度和光敏感上,前者明顯優(yōu)于后者,因此可以用Alexa Fluor488取代FITC。

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