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流式抗體選擇技巧系列Ⅰ——單色熒光標(biāo)記
閱讀：643 發(fā)布時(shí)間：2018-10-17流式抗體選擇六步曲
特異性靶蛋白：確定要檢測(cè)目的細(xì)胞特異性靶蛋白。
種屬：嚴(yán)格按照待測(cè)樣本種屬選擇抗體。
應(yīng)用領(lǐng)域：可用于流式實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明書(shū)中明確標(biāo)注經(jīng)FCM實(shí)驗(yàn)測(cè)試，有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖和用量說(shuō)明；若還可做熒光染色等多用途則更佳。
抗體克隆號(hào)：同一抗體多個(gè)克隆號(hào)的情況下，可以選擇熒光標(biāo)記種類(lèi)多的那個(gè)克??；若文獻(xiàn)中有被引用，首先選擇被引用的抗體克隆號(hào)。
盡量選擇直接標(biāo)記的抗體：直接標(biāo)記抗體是指熒光素標(biāo)記的單克隆或多克隆一抗，一步染色，操作方便，影響因素少，結(jié)果準(zhǔn)確。
同型對(duì)照：與一抗的來(lái)源，Ig分型和標(biāo)記*一致，使用時(shí)與一抗相同的濃度。
標(biāo)記方法的選擇——直標(biāo)or間標(biāo)(Biotin)根據(jù)抗原表達(dá)豐度來(lái)選擇：
直標(biāo)抗體(一步法)：待測(cè)抗原表達(dá)豐度高的盡量選擇直標(biāo)抗體。
間標(biāo)抗體：待測(cè)抗原表達(dá)豐度低的要考慮選擇間接標(biāo)記抗體（無(wú)熒光一抗 + 熒光二抗——兩步法）或生物素標(biāo)記抗體（無(wú)熒光一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + 熒光標(biāo)記鏈霉親和素——三步法）。
熒光抗體的選擇：
1、確定流式細(xì)胞儀的參數(shù)配置
在設(shè)計(jì)流式方案前，根據(jù)可能需要同時(shí)檢測(cè)指標(biāo)的多少數(shù)量，先確定需要在哪臺(tái)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)該儀器的參數(shù)配置，要了解以下幾個(gè)方面信息：
激光器：常見(jiàn)的流式細(xì)胞儀有355nm、488nm和640nm三個(gè)激光器，但有些機(jī)器在購(gòu)買(mǎi)時(shí)因某些原因，只裝了一個(gè)488nm激光器，所以需要注意型號(hào)相同的機(jī)器也未必激光配置相同。
濾光片：也就是有幾個(gè)檢測(cè)通道，這決定了你多可以同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)。
儀器的具體型號(hào)：有助于再次確定檢測(cè)通道。因?yàn)橥粋€(gè)熒光在不同的流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，有時(shí)候檢測(cè)通道也是不一樣的。
流式細(xì)胞儀中常用的熒光染料光學(xué)特征以及需要的激光器
2、熒光的選擇建議
熒光本身有強(qiáng)弱之分，可視抗原表達(dá)強(qiáng)弱及分群情況選擇合適的熒光?？乖磉_(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光例如：PE、APC；反之，抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC。
常用熒光強(qiáng)弱排序程度為：PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC。
類(lèi)似熒光的取代：Alexa Fluor、eFluor等這些熒光非常明亮，對(duì)激光穩(wěn)定性好，對(duì)PH 值不敏感，具有水溶性。如Alexa Fluor488與FITC檢測(cè)通道相同，但是熒光強(qiáng)度和光敏感上，前者明顯優(yōu)于后者，因此可以用Alexa Fluor488取代FITC。