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雜交瘤細(xì)胞和重組抗體
閱讀：334 發(fā)布時(shí)間：2018-8-24概述
在過(guò)去的二十五年里,利用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)了成千上萬(wàn)的鼠單克隆抗體.人們用同樣的技術(shù)從轉(zhuǎn)基因鼠中克隆人類的抗體,并設(shè)計(jì)了全長(zhǎng)型抗體和重組片段,它們可以被用于多種診斷和治療.而且如果他們能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞,牛奶及植物中表達(dá),就可以大量獲得.
一個(gè)世紀(jì)以前,Paul Ehrlich提出了的側(cè)鏈理論來(lái)解釋抗原抗體的相互作用.他不久又鑄造了一個(gè)虛構(gòu)的短語(yǔ)"魔彈"來(lái)形容抗體對(duì)準(zhǔn)及中和抗原.七十五年以后 Georges K hler and César Milstein發(fā)明了單克隆抗體技術(shù),因此為細(xì)胞生物學(xué)和臨床診斷學(xué)的巨大進(jìn)步鋪平了道路.
鼠和人的單克隆抗體
抗體分泌雜交瘤是由生長(zhǎng)是不確定的骨髓瘤細(xì)胞得到的.一些不能分泌的骨髓瘤細(xì)胞系缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)化酶(HGPRT), 被確定作為融合配偶 .
為了選擇成功的融合細(xì)胞,細(xì)胞須在一個(gè)含有次黃嘌呤,氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的介質(zhì)中培養(yǎng),這樣只有融合細(xì)胞可以增生.
噬菌體的發(fā)展加強(qiáng)了抗體庫(kù)的篩選,從而為獲得人類單克隆抗體提供了新的手段.
.人類抗體基因的轉(zhuǎn)移
用同源重組技術(shù)刪除重鏈結(jié)合區(qū)(JH)及Ck區(qū)可以遏制鼠胚胎干細(xì)胞上的IgH和IgK的基因位點(diǎn),這樣的小鼠不產(chǎn)生抗體.
要達(dá)到有效的人類抗體基因轉(zhuǎn)移,需要克隆酵母菌人工染色體(YACs),因?yàn)樗梢院痛笃蔚娜旧wDNA吻合.
通過(guò)融合缺乏鼠HGPRT的ES細(xì)胞和包含YAC的酵母菌原生質(zhì)球,終將YAC插入片段整合到鼠的胚系上.被選擇的ES細(xì)胞微量注入胚細(xì)胞后,產(chǎn)生成功整合人抗體序列的小鼠,該序列可以在DNA胚系里編碼大部分IgH和IgK基因位點(diǎn).
轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的人抗體
免疫后的轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生功能上很重要的高親和力的人抗體.通過(guò)普通的雜交瘤技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)克隆和生產(chǎn).
鼠體內(nèi)的人抗體和人細(xì)胞產(chǎn)生的人抗體可以通過(guò)他們糖基化的狀態(tài)加以區(qū)別 .
預(yù)期的結(jié)果在初的實(shí)驗(yàn)中達(dá)到了,該實(shí)驗(yàn)利用含人抗體的小鼠和由鼠分離的雜交瘤細(xì)胞和嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞系得到人抗體.
抗體片段的重組
由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的Fv片段,是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的小免疫球蛋白片段.然而,Fvs的兩條鏈的結(jié)合力比Fab段的要低,Fab段也是由CH1和CL的不變區(qū)組成的.VH和VL之間是由肽段連接的,二硫鍵和"節(jié)和孔突變"可以加固他們的連接.
單鏈Fv片段
scFv在非靶組織中滯留時(shí)間較短,在血液中清除速度較快且更易侵入腫塊.它有較低的免疫原性,并較易和蛋白質(zhì)及肽結(jié)合.
單一抗體片段
它和輕鏈可變區(qū)相互作用的粘連的碎片影響了他們的溶解度和穩(wěn)定性.它和抗原的親和力較低而且和不相干的抗原有交叉反應(yīng)的趨勢(shì).
構(gòu)建多價(jià)體Fv抗體
為了增加單價(jià)體scFv的親和性,可以強(qiáng)制縮合肽段使它們形成多聚體.
產(chǎn)生式系統(tǒng)
細(xì)菌,酵母菌,植物,昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抗體和抗體片段的產(chǎn)物都有它的表達(dá)系統(tǒng).
細(xì)菌:不能裝配所有糖基化的抗體,但是可以裝配抗體片段的產(chǎn)物.
酵母菌:可以表達(dá)完整的抗體,但含有高的甘露糖和多分支的寡糖,而且在效應(yīng)器功能方面有缺陷.
攜帶桿狀病毒群的昆蟲(chóng)細(xì)胞植物:它們的抗體都含有碳水化合物,但結(jié)構(gòu)上和哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的不同.
骨髓瘤細(xì)胞和哺乳動(dòng)物非淋巴樣細(xì)胞:都可以表達(dá)全功能抗體.
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)
哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)的重組子抗體,暫時(shí)或穩(wěn)定的決定于所需要的蛋白質(zhì)量.
為了獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體細(xì)胞系,可以廣泛的應(yīng)用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或鼠骨髓瘤細(xì)胞系.利用占優(yōu)勢(shì)的或隱性的擴(kuò)增標(biāo)記進(jìn)行載體擴(kuò)增后,可以增加這些細(xì)胞的生產(chǎn)力.
骨髓瘤細(xì)胞可以被表達(dá)載體轉(zhuǎn)染,該載體包含免疫球蛋白基因和谷氨酰胺合成酶基因,骨髓瘤細(xì)胞可以在游離谷氨酸的介質(zhì)中培養(yǎng).
含抗體的奶
為了使哺乳動(dòng)物的乳腺產(chǎn)生乳蛋白以外的其它蛋白質(zhì),可以從超排卵供體的輸卵管微量注射數(shù)百個(gè)復(fù)制體到受精卵而引入胚系序列,使外來(lái)基因和DNA融合,這些基因編碼乳房特殊調(diào)節(jié)序列.經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的離體培養(yǎng),可以把胚胎轉(zhuǎn)移到假孕動(dòng)物的輸卵管或子宮,并發(fā)育到產(chǎn)期.
初的奶純化階段使用普通的操作,也就是移去酪蛋白和脂肪.澄清的乳清包含高濃度的相關(guān)抗體,它可以通過(guò)離子交換和親和層析來(lái)純化.純化的抗體和從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中得到的抗體沒(méi)有區(qū)別.
重組子抗體的細(xì)菌產(chǎn)物
離體培養(yǎng)重組后的大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)包涵體可以產(chǎn)生抗體片段.分子內(nèi)二硫鍵形成功能性抗體片段可以分泌到壁膜間隙甚至大腸桿菌的介質(zhì),這需要熔合細(xì)菌信號(hào)肽到抗體N末端.然而,高水平表達(dá)常常導(dǎo)致不溶解的抗體片段轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)后積累.
大腸桿菌一些折疊部分的過(guò)度表達(dá),不能增加可溶性抗體片段的產(chǎn)量.對(duì)照的,共轉(zhuǎn)染細(xì)菌周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后會(huì)增加產(chǎn)量.
結(jié)論
從雜交瘤細(xì)胞得到的鼠單克隆抗體提供了生物學(xué)臨床研究和診斷的重要工具.僅人類基因組工程預(yù)期能定義大約100,000個(gè)編碼同等數(shù)量蛋白質(zhì)的功能基因.
激動(dòng)人心的發(fā)展之一是人單克隆抗體的治療上的應(yīng)用,它比鼠抗體更有效和安全.Ehrlich的早的關(guān)于"魔彈"的預(yù)言將會(huì)被實(shí)現(xiàn).