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細(xì)胞共定位
閱讀：630 發(fā)布時間：2018-7-19實驗試劑
高保真聚合酶(pfu ultra)，限制性內(nèi)切酶(XhoI、SpeI、BamHI、SpeI、SacI)，金粉，無水乙醇，2.5MCaCl2，20ul 0.1M亞精胺
實驗設(shè)備
PCR擴(kuò)增儀，PDS-1000/He型基因槍，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 510 )
實驗材料
洋蔥
實驗步驟
1. 載體的構(gòu)建
pA7- CFP- AtCOP1，pA7-AtCRY1-YFP
pA7- CFP-OsCOPl，pA7-OsCRY1b-YFP
中間載體pA7-CFP和pA7-YFP為本實驗室構(gòu)建。將AtCOPl(引物為AtCOP1XhoI5' 和AtCOP1 SpeI3')和AtCRYl(引物為AtCRY1XhoI5'和AtCCT1SpeI3')分別用高保真聚合酶(pfu ultra)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物，用XhoI/SpeI雙酶切后，分別連接入pA7-CFP和pA7-YFP的多克隆位點上，得到pA7-AtCOP 1-CFP，pA7-AtCRYl-YFP。
將OsCRYlb用高保真聚合酶(pfu ultra)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物為OsCRY 1 bBamHI5'和OsCCTlbSpeI3')，純化PCR產(chǎn)物，用BamHI/SpeI雙酶切后連接入pA7-YFP的多克隆位點中，得到pA7-OsCRYlb-YFP。
將嵌合的OsCOPl用高保真的聚合酶(pfu ultra)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物為AtCOP1XhoI5'和 OsCOP1SacI3')，純化PCR產(chǎn)物，用XhoI/SacI雙酶切后連接入pA7-YFP的多克隆位點SalI/SacI中，得到pA7-OsCOPl-CFP。所有克隆經(jīng)DNA測序正確后使用。
2. 基因槍操作
1) 微彈制備(金粉母液制備)
a. 稱取60mg(或3mg)金粉加入Eppendorf管。
b. 加入1mL(或50uL)無水乙醇，振蕩lmin，10,000rpm離心l0s。
c. 棄上清，加入1mL(或50uL)無菌水，振蕩lmin，10,000rpm離心l0s。
d. 棄上清，加入1mL(或50uL)無菌水，振蕩1 min，-20℃保存。
2) DNA的包裹
a. 取50uL金粉懸液于Eppendorf管。
b. 依次加入5uL質(zhì)粒DNA (1ug/ul)，50ul 2.5MCaCl2和20ul 0.1M亞精胺(每加完一樣，振蕩2-3秒)。
c. 振蕩3min，10,000rpm離心10-20秒，棄上清。
d. 加250ul無水乙醇，振蕩重懸，10,000rpm離心10-20秒，棄上清。
e. 用60ul無水乙醇定容(需重懸)。
3) 基因槍操作
a. 基因槍轟擊的前一天將新鮮洋蔥的鱗葉切成小塊(3-5cm長寬)，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。
b. 轟擊之前將洋蔥的內(nèi)表面朝上，用PDS-1000/He型基因槍將上述質(zhì)粒轟擊入洋蔥內(nèi)表皮，黑暗培養(yǎng)24h。
c. 激光共聚焦顯微鏡觀測(Carl Zeiss LSM 510 )。