一、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

一、實(shí)驗(yàn)方法

1. 培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500uL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞80%粘連。

 2. 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物

A) 用100μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，輕輕混勻；

B) 用100μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋RBP過(guò)表達(dá)載體，輕輕混勻；

C) Lipofectamine 2000使用前，輕輕混勻，用100μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2.5μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5min；

D) 將A、 B、C的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20min，轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。

3. 將24孔板中200μl 培養(yǎng)基，再分別加入300uL上述混合液，每孔終體積為500uL。質(zhì)粒濃度均為500ng/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

5. 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-6h后，吸掉上清液，加入500uL的*培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后備用。

二、雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

 雙熒光檢測(cè)試劑盒(promega E1910)

脫色搖床(海門(mén)市其林貝爾TS200A)，低溫冷凍離心機(jī) (Sigma 3K15)，發(fā)光檢測(cè)儀 (Molecular Devices SpectraMax®i3 )。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

具體實(shí)驗(yàn)步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)

裂解細(xì)胞 ：吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后， PBS輕柔漂洗兩次，參考下表加入適量的1×PLB裂解液(用去離子水將5×Passive Lysis Buffer母液稀釋成1×PLB，可在4℃保存1個(gè)月)，室溫?fù)u床放置15min充分裂解后備用。

注：細(xì)胞裂解后可以立即測(cè)定，也可以先凍存，待以后再測(cè)定。凍存樣品需融解，并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定。

水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后，加入到1劑量的Luciferase Assay Substrate凍干粉中，充分溶解后分裝成若干小管，儲(chǔ)存在-20℃(≦1個(gè)月)或-70℃(≦1年)，使用前水浴解凍，上下顛倒兩次并恢復(fù)至室溫備用

按照每個(gè)樣本100uL用量，取適量50×Stop & Glo®Reagent，用Stop & Glo®Buffer稀釋成1×Stop & Glo®Reagent，現(xiàn)配現(xiàn)用。

按儀器操作說(shuō)明書(shū)開(kāi)啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀，將測(cè)定間隔設(shè)為2秒，測(cè)定時(shí)間設(shè)為10秒。

每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)，取樣品20uL，加入100uL LARⅡ試劑，用槍打勻后測(cè)定RLU1(relative light unit)。

加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用槍打勻后測(cè)定RLU2(relative light unit)。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析