详细介绍
实时荧光定量PCR:
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:
1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性定量方法,已得到,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
操作流程
收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体连接,取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆(酶切法或PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆信息输入数据库——>质粒实物保存。
产品名称 | 分类 | 规格 |
猪疱疹病毒PCR检测试剂盒 | PCR检测试剂盒 | 50T |
下列相关产品:
小鼠血管紧张素转化酶(ACE)PCR检测试剂盒 ,英文名: ACE
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人活性氧(ROS)免疫试剂盒 Human Reactive OXyen Species,ROS
RatCollageypeⅡ,ColⅡELISAKit大鼠Ⅱ型胶原(ColⅡ)PCR检测试剂盒
10倍细菌合成基础培养液100毫升
MouseComplemefragme4a,C4aPCR检测试剂盒小鼠过敏毒素/
PCR实验方法步骤:
方法
1:在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2:调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,在72℃ 保7min。
3:伴放线放线杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4:PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
定量PCR方法:
a、竞争法 产品仅用于科研实验
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗di高辛酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的。
操作流程:
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
下列是公司正在销售的产品:
大鼠酚(PYD)ELISA试剂盒 ,英文名: PYD ELISA Kit
Mouse beta galactosidase (beta GAL) ELISA Kit 小鼠β半乳糖苷酶(βGAL)ELISA试剂盒
ELISA 小鼠Fibronectin(mouse Fibronectin) 48T/96T 进口分装
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非哺乳动物封阻缓冲液100毫升
ELISAKitTPA人组织多肽抗原规格:48T/96T
猪疱疹病毒PCR检测试剂盒GRB2/ASH peptide 生长因子受体结合蛋白2抗原Multi-class antibodies规格: 0.5mg
Oct4 Oct4 鼠单抗 (FITC) Human
Rhesus antibody Rh phospho-CstF64(Ser498) 0酸化细胞分裂相关蛋白CSTF64抗体 规格 0.1ml
染色液 100ml 自产
ZNF704 英文名称: 锌指蛋白704抗体 0.2ml
DCUN1D2 英文名称: DCN1样蛋白2抗体 0.2ml
Oct4 Oct4 鼠单抗 (FITC) Human