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豬肝星狀細(xì)胞永生化細(xì)胞專用培養(yǎng)基凍存 

1）離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中；

2）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；

3）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。續(xù)寫內(nèi)容如下：

為確保細(xì)胞凍存后的存活率和功能穩(wěn)定性，后續(xù)還需進(jìn)行復(fù)蘇驗(yàn)證。具體步驟如下：

1. **復(fù)蘇準(zhǔn)備**：從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中輕柔搖晃，使細(xì)胞懸液在1-2分鐘內(nèi)融化。注意避免長時(shí)間高溫暴露，以防細(xì)胞損傷。

2. **離心洗滌**：將融化的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，緩慢加入5mL預(yù)熱的培養(yǎng)基以稀釋凍存液。隨后以300×g離心5分鐘，棄上清以去除殘留的凍存保護(hù)劑。

3. **重懸接種**：用適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕柔吹打均勻后接種至預(yù)處理好的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況，更換新鮮培養(yǎng)基以去除未存活細(xì)胞碎片。

4. **質(zhì)量評估**：復(fù)蘇后48小時(shí)，通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞比例，同時(shí)可進(jìn)行免疫熒光染色（如GFAP、α-SMA）或功能實(shí)驗(yàn)（如吞噬檢測）以確認(rèn)星狀細(xì)胞的表型和活性。若活率低于80%，需優(yōu)化凍存程序或調(diào)整凍存液配方。

**注意事項(xiàng)**：

- 全程操作需無菌，避免反復(fù)凍融；

- 液氮儲(chǔ)存時(shí)確保凍存管密封性，防止爆炸風(fēng)險(xiǎn)；

- 長期保存需定期檢查液氮罐液位，避免細(xì)胞失活。

通過上述標(biāo)準(zhǔn)化流程，可最大限度保留豬肝星狀細(xì)胞的永生化特性，為后續(xù)肝纖維化研究或藥物篩選提供穩(wěn)定細(xì)胞資源。