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siRNA轉(zhuǎn)染標準操作流程
以下是經(jīng)過優(yōu)化的 siRNA轉(zhuǎn)染標準操作流程，整合了關鍵參數(shù)優(yōu)化與避坑指南，適用于絕大多數(shù)哺乳動物細胞系（貼壁/懸?。?，分為 實驗設計、操作步驟、質(zhì)控要點三部分：
一、實驗設計關鍵點（轉(zhuǎn)染前必看）
要素 | 推薦方案 | 避坑提示 |
siRNA濃度 | 終濃度10-50nM（預實驗梯度測試） | ＞100nM易致脫靶效應 |
細胞密度 | 貼壁細胞：30-50%匯合度 | 過密→毒性↑；過低→效率↓ |
轉(zhuǎn)染試劑 | Lipofectamine™ RNAiMAX（通用） | 避免含血清培養(yǎng)基稀釋試劑 |
對照設置 | - 陰性對照：Scrambled siRNA | 缺一不可！ |
二、標準操作流程（以24孔板為例）
Day 0：細胞鋪板
1. 消化細胞 → 用wanquan培養(yǎng)基 調(diào)整密度 → 每孔接種 0.5mL（貼壁細胞數(shù)：5-8×10?；懸浮細胞數(shù)：2×10?）
2. 37℃培養(yǎng)箱放置 16-24h（目標：轉(zhuǎn)染時匯合度≈40%）
關鍵細節(jié)：
- siRNA工作液濃度 = 儲存濃度×30（例：20μM儲存液→工作液終濃度≈33nM）
- 轉(zhuǎn)染試劑用量參考說明書（RNAiMAX通常 試劑:siRNA體積比=1:1）
Day 2：換液與檢測
1. 轉(zhuǎn)染后 6h 更換wanquan培養(yǎng)基（高毒性細胞如原代神經(jīng)元需4h內(nèi)換液）
2. 繼續(xù)培養(yǎng) 24-72h（基因沉默峰值時間需預實驗確定）
三、質(zhì)控關鍵步驟（決定成?。。?/span>
1. 轉(zhuǎn)染效率驗證（必做）
- 方案1：轉(zhuǎn)染 FAM標記siRNA → 24h后熒光顯微鏡觀察（效率＞80%合格）
- 方案2：共轉(zhuǎn)染 EGFP質(zhì)粒 → 計算綠色細胞占比（成本低但間接）
2. 沉默效果檢測
3. 細胞毒性評估
- MTT法：轉(zhuǎn)染后24h檢測，存活率應＞85%
- 形態(tài)觀察：懸浮細胞聚團、貼壁細胞空泡化→提示毒性過強
四、高頻問題解決方案
問題 | 原因 | 優(yōu)化方案 |
效率低 | siRNA降解/試劑失效 | 新解凍siRNA；更換轉(zhuǎn)染試劑批次 |
細胞死亡率高 | 復合物局部濃度過高 | 轉(zhuǎn)染前混勻培養(yǎng)基；懸浮細胞用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法 |
沉默效果不穩(wěn)定 | 基因半衰期長 | 延長檢測至72h；轉(zhuǎn)染兩次（間隔24h） |
脫靶效應 | siRNA種子區(qū)匹配非靶基因 | 更換siRNA序列；使用化學修飾siRNA（如Stealth™） |
五、特殊細胞優(yōu)化方案
1. 原代細胞：
- 轉(zhuǎn)染試劑：選 DharmaFECT™ Primary 或 jetPRIME®
- 方案：轉(zhuǎn)染前饑餓處理2h（無血清培養(yǎng)基）→ 復合物孵育時間縮短至5min
2. 懸浮細胞：
- 試劑：Neofect™ DNA/RNA Transfection Reagent
- 步驟：離心收集細胞 → 重懸于復合物 → 24孔板每孔接種500μL（密度5×10?/mL）
3. 難轉(zhuǎn)細胞（如神經(jīng)元）：
- 專用試劑：NeuroFect™（佐劑提高穿透性）
- 轉(zhuǎn)染后不換液 → 直接補等體積wanquan培養(yǎng)基
六、試劑耗材推薦表
類型 | 推薦產(chǎn)品 | 適用場景 |
通用轉(zhuǎn)染試劑 | Lipofectamine™ RNAiMAX | 293T/HeLa等常見細胞 |
難轉(zhuǎn)細胞試劑 | jetPRIME® | 原代/干細胞/懸浮細胞 |
陽性對照siRNA | Silencer™ GAPDH siRNA | 體系驗證 |
陰性對照 | AllStars Neg. siRNA | 排除非特異效應 |
> 數(shù)據(jù)標準：合格實驗需滿足——轉(zhuǎn)染效率＞80% + 沉默效率＞70% + 細胞存活＞85%
避雷總結(jié)：
1. 勿用含抗生素或血清的培養(yǎng)基稀釋復合物（滅活試劑）
2. 轉(zhuǎn)染后換液時間寧早勿晚（超8h毒性飆升）
3. 凍存siRNA避免反復凍融＞3次（分裝儲存-80℃）
按照此流程操作，可穩(wěn)定獲得可重復的基因沉默數(shù)據(jù)！
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