化工儀器網
技術文章
轉基因大豆MON87705品系核酸檢測試劑盒?反應流程常規(guī)程序
閱讀：342 發(fā)布時間：2021-10-13轉基因大豆MON87705品系核酸檢測試劑盒反應流程常規(guī)程序:
將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNApian段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。
2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。
3．反應時間
變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。
平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產物抑制作用，非特異性產物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不*。
5．PCR反應液的配制
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。
按照常規(guī)的方法配制反應體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。
蛋白激酶A2抗體
血管緊張素Ⅱ受體2抗體
ASH1蛋白抗體
芳香乙酰胺脫乙?；笜拥鞍?抗體
血管內皮細胞遷移蛋白抗體
醛糖還原酶相關蛋白質抗體
膽汁酸結合蛋白DDH2抗體
血管生成素樣蛋白3抗體
甘油酯激酶線粒體抗體
磷酸化內收蛋白a1抗體
自噬體ATG16L2蛋白抗體
睪丸酸性磷酸酶抗體
酸性磷酸酶抗體
極光激酶A相互作用蛋白1抗體
載脂蛋白樣蛋白6抗體
凋亡相關蛋白TGFb信號抗體
A2LD1蛋白抗體
α1,4-N-乙酰葡糖胺轉移酶α4Gn-T抗體
芳香乙酰胺脫乙酰基酶抗體
芳香乙酰胺脫乙?；笜拥鞍?抗體
氨基乙二酸半醛脫氫酶磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶抗體
賴氨酸酮戊二酸還原酶抗體
錨蛋白重復域6抗體
精氨酸酶2抗體
醛固酮還原酶家族1成員C3抗體
促腎上腺皮質激素受體
褐黑素相關蛋白ART抗體
腎上腺皮質線粒體鐵氧還蛋白抗體