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技術(shù)文章

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH) 樣本的前處理

閱讀:553          發(fā)布時(shí)間:2021-7-7

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH) 樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿 600g,4℃離心5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 NOX(此步可選做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于NOX活性測(cè)定。

血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

(1)試劑四于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min。

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五,混勻,記錄600nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

NOX 活力單位的計(jì)算

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)NOX活力的計(jì)算:

單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變

 

AlbuminEgg 1g/5g/25g原裝 Sigma A5378
(卵清蛋白
(雞))
AlcianBlue8GX 1g/5g Amresco分裝
(阿爾新藍(lán),阿利新蘭)
Alloxan 5g/10g Sigma分裝
(四氧嘧啶)
Amethopterin 10mg/25mg/100mg Sigma A6770
(氨甲喋呤)
AmidoBlack10B 5g/10g/100ml Amresco分裝
(氨基黑)
Amidoblack10B 5g/10g/25g/100g原裝 Sigma N3393
(氨基黑10B)
AmikacinSulfate 5g原裝 INALCO1758-9312
(丁胺卡那霉素)
Aminopterin 5mg/10mg/50mg Sigma A-1784
(氨基喋呤)
AmmoniumPersulfate 50g/100g Sigma分裝
(過硫酸銨)
Ammoniumsulfate 250g/500g/1kg/5kg Amresco 0191
(硫酸銨)
Ampholine PH4-6/5-7/6-9/3-9.5 國產(chǎn)
(兩性電解質(zhì)) 12ml
AmphotericinB 50mg/100mg/1g原裝 Amresco E437
(Solubilized)
(可溶性兩性霉素B)

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