簡介

開發(fā)更復雜的、生物相關的、預測性的基于細胞的化合物篩選分析是藥物發(fā)現(xiàn)的主要挑戰(zhàn)之一。人們對使用三維(3D)培養(yǎng)物進行檢測開發(fā)和轉錄生物學越來越感興趣。3D培養(yǎng)被認為具有密切概括人體組織方面的優(yōu)勢，包括結構，細胞組織，細胞-細胞和細胞-基質相互作用，以及更多生理相關的擴散特征。水凝膠被廣泛用作人工細胞外基質，用于在三維環(huán)境中培養(yǎng)神經細胞。完全合成的水凝膠被預先澆鑄在96孔板上，具有深度表面密度梯度，促進沉積在水凝膠表面的細胞在3D中的滲透(3DProSeedTM水凝膠)。該平臺具有高度的易用性和高度的自動化兼容性。

人類誘導多能干細胞(iPSC)來源的神經元越來越多地用于生理細胞模型的開發(fā);與原代細胞和動物模型相比，它們的人類起源、長期的培養(yǎng)活力和高容量的可用性使它們在神經科學應用方面相對于初代細胞和動物模型更具優(yōu)勢。

目的

本研究的重點是利用ipsc來源的神經元在水凝膠基質中發(fā)育，開發(fā)一種高通量3D神經突生長實驗，其長期目標是建立兼容自動化的神經退行性和神經毒理學篩選3D模型。

方法

ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦高內涵成像系統(tǒng)

配有寬場和共聚焦(60μm 針孔)光路

MetaXpress® High-Content 高內涵圖像采集和分析軟件

實驗開發(fā)

用于實驗的細胞是CNS.4UTM (Ncardia)，這是一種iPSC來源的細胞混合物，由神經元(谷氨酸能、多巴胺能和GABA能)以及星形膠質細胞組成。

Ectica Technologies提供的3DProSeedTM 96孔板。該孔板含有預先澆鑄的全合成聚乙二醇基水凝膠。水凝膠具有較深的表面密度梯度，促進神經突的三維浸潤和三維網絡的建立。該水凝膠平臺使用簡單，自動化兼容性高(Simona et al. 和 Zhang et al.)。

水凝膠3D神經網絡的形成

CNS.4U細胞在3DProSeed水凝膠中培養(yǎng)14天。細胞在200 μL培養(yǎng)液中以40000個神經元/孔接種。接種密度可以改變。培養(yǎng)基組成為50:50的神經基礎培養(yǎng)基+ DMEM/F12 +補充劑(Ncardia)

細胞首先沉淀在水凝膠表面，然后滲透到水凝膠內部。神經突在移植后約24小時開始形成，在培養(yǎng)過程中延長至14天。隨著時間的推移，神經突網絡的形成使用透射光和共聚焦成像進行監(jiān)測。

染色

終點測量用4%的甲醛固定細胞，然后用0.01%的Triton X-100滲透，用針對TuJ-1神經元標記的熒光基團偶聯(lián)抗體和Hoechst核染料進行染色。

參考文獻

1. Simona B.R. et al., Biomater. Sci., 3:586-591, 2015.

2. Zhang N. & Milleret V., SLAS Discovery, accepted, 2017.

3. Sirenko et al., Assay and Drug Dev Technologies12(9-10):536-47

結果：3D培養(yǎng)物的表型分析

成像

采用高內涵成像和分析技術對神經網絡進行評價。我們優(yōu)化了細胞培養(yǎng)和染色，并開發(fā)了共聚焦成像和分析方案，用于評估神經元在3D基質中的形態(tài)和活力。使用ImageXpress® Micro Confocal共聚焦高內涵成像系統(tǒng)(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)和10X或4X物鏡，沿對焦軸(Z-stack)在不同平面上獲取一系列圖像。獲得了11-33個平面堆棧，間距為5-10 μm，覆蓋深度約為100-300 μm。保存所有單獨的圖像并用于3D分析，以及2D投影(最大投影或Best Focus)圖像。

共聚焦圖像，Z-stack, 30 μm 間距

圖1. 將CNS.4U細胞接種于3DProSeed，在共聚焦模式下成像14天。細胞核用Hoechst染色(紅色)以及TuJ -1微管蛋白染色(綠色)。四個平面代表凝膠中的不同焦平面。神經突網絡延伸到水凝膠中幾百微米。

圖像分析

自動定量分析采用2種方法:投影圖像分析(2D)或3D分析。使用神經突生長算法分析2D最大投影圖像。表型讀數(shù)包括通過多種讀數(shù)來定量表征神經網絡的范圍和復雜性，包括測量神經突的生長，主干和分支的數(shù)量，以及細胞數(shù)量和活力。投影圖像的分析速度更快，并且可以很好地定量。

圖2. 將CNS.4U細胞以不同的播種密度(5000 - 80000個細胞/凝膠)接種在3DProSeed上。細胞培養(yǎng)14天，使用ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)成像。3D成像(Z-stacking)，并使用最大投影進行分析。分析允許自動測量細胞數(shù)量，神經突生長(神經突長度)，以及主干和分支的數(shù)量。上層平面表示透射光投影圖像和用于神經元檢測的疊加分析掩模。圖表顯示了各種測量結果與孔板神經元數(shù)量的相關性。三個復孔的平均值。

3D可視化和3D圖像分析

分析軟件允許組合來自不同平面的對象以及細胞和網絡的3D可視化。自定義模塊用于定義“纖維”的生長和細胞核。首先在每個平面中找到對象，然后使用“connect by best match”功能在3D空間中連接。3D分析通常需要更長的時間，但可以對體積中的物體(包括重疊的物體)進行更好的分辨和定量分析。

圖3. 左圖:MetaXpress軟件對水凝膠中細胞和網絡的3D可視化。3D可視化顯示細胞核(假色)、TuJ-1陽性的神經突和細胞體(紅色)。中圖:在單個平面中定義的“纖維”的分析掩膜。通過3D分析確定每孔纖維(神經突)的數(shù)量、纖維(神經突)的總體積、分支點的數(shù)量和細胞(細胞核)的數(shù)量。圖表顯示了測量結果與孔板神經元數(shù)量(三次重復)的相關性。

3D水凝膠神經毒性實驗

表型讀數(shù)包括通過多種讀數(shù)定量表征神經網絡的范圍和復雜性。我們評估了測定的可重復性，描述了多次測量，并測試了一系列已知的神經毒物化合物。比較了兩種分析方法:使用標準神經突生長算法分析投影圖像和使用定義纖維、分支和細胞核的自定義模塊進行3D分析。

圖4. 在接種后72h，將三種已知具有神經毒性作用的化合物以不同的濃度添加到神經元培養(yǎng)物中，濃度范圍為0 ~ 10 μM。

上圖:化合物對神經元發(fā)育的抑制作用。如上所述對細胞進行染色和成像。

上圖:使用2D壓縮圖像(最大投影)進行分析。測定神經突生長、細胞數(shù)、主干和分支數(shù)。神經突生長的濃度-響應曲線顯示:甲基汞(紅色，IC50 5nM)，狄氏劑(藍色，IC50 170nM)和魚藤酮(綠色，IC50 220nM)。IC50值與3D分析相當(下圖)，使用標準2D神經元細胞培養(yǎng)獲得結果(Sirenko等)。

下圖:3D分析結果。測量神經突(纖維)數(shù)量、纖維(神經突)體積、分支點和總細胞數(shù)。神經突總體積(μm3)的濃度響應曲線:甲基汞(紅色，IC50 2nM)，狄氏劑(藍色，IC50 170nM)，魚藤酮(綠色，IC50 750nM)。

總結

利用3DProSeedTM水凝膠對iPSC來源的CNS.4UTM神經細胞進行3D培養(yǎng)和共聚焦高內涵成像，我們開發(fā)了一種定量高通量分析方法，可以評估3D神經元培養(yǎng)物的活力和形態(tài)變化。

更高的分辨率和多參數(shù)分析允許神經突和單細胞計數(shù)，并在3D中統(tǒng)計表征神經突的發(fā)育和分支。2D和3D分析能夠表征神經網絡，并提供定量測量，可用于定義IC50值并比較各種化合物的毒性。