大鼠Ⅱ型膠原（ColⅡ）定量檢測試劑盒【檢測原理】

本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標準品、待測樣本加入到預(yù)先包被大鼠Ⅱ型膠原（ColⅡ）單克隆抗體透明酶標包被板中，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標工作液，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中大鼠Ⅱ型膠原（ColⅡ）濃度呈正相關(guān)，450nm波長下測定OD值，根據(jù)標準品和樣品的OD值，計算樣本中大鼠Ⅱ型膠原（ColⅡ）含量。

【試劑盒組成】

1

酶標包被板

12孔×8條

7

顯色劑A液

6mL

2

標準品

0.6mL

8

顯色劑B液

6mL

3

20倍濃縮洗滌液

25mL

9

終止液

6mL

4

樣本稀釋液

6mL

10

說明書

1份

5

標準品稀釋液

6mL

11

封板膜

2張

6

酶標試劑

6mL

12

密封袋

1個

備注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：8、4、2、1、0.5、0.25 μg/L

【需要而未提供的試劑和器材】

1、37℃恒溫箱

2、標準規(guī)格酶標儀

3、精密移液器及一次性吸頭

4、蒸餾水

5、一次性試管

6、吸水紙

大鼠Ⅱ型膠原（ColⅡ）定量檢測試劑盒【操作步驟】

1、準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。

2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加標準品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

6、加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。

7、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

8、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。

10、終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

12、計算：根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

【樣本要求】

1、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2、標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。

【注意事項】

1、實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。

2、酶標包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

3、建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。

4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。

5、若顯色過淺，可適當(dāng)延長底物溫育時間。

6、為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。

7、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號的試劑不得混用。

8、底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

【操作程序總結(jié)】

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板4次，加入酶標試劑，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板4次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘

加入終止液

15分鐘之內(nèi)讀OD值

【檢測范圍】

0.25μg/L - 8μg/L

【規(guī)格】

96T/盒

【貯藏】

2-8℃，避光防潮保存。

大鼠Ⅱ型膠原（ColⅡ）定量檢測試劑盒【有效期】

6個月