細(xì)胞瓊脂克隆斑形成實(shí)驗(yàn)方法

1.取MDA-435-OL-Sec23a-GFP和MDA-435-OLLV3NC-GFP對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液, 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后備用。

2.使用梯度稀釋法適當(dāng)稀釋細(xì)胞懸液后, 向6孔板的每個(gè)孔內(nèi)分別加入含50 個(gè)細(xì)胞的2 mL細(xì)胞懸液, 細(xì)胞懸液使用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液配制。每種細(xì)胞均設(shè)置3個(gè)6孔板復(fù)孔。

3.12 h后鏡下可觀察到6孔板內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)全部貼壁, 此時(shí)將皿中培養(yǎng)液換成瓊脂濃度為0.2%的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液, 置于37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4.10 d后鏡下可觀察到6孔板內(nèi)出現(xiàn)集落生長的細(xì)胞克隆斑。此時(shí)棄去含瓊脂的培養(yǎng)液, 用PBS 輕輕潤洗2次, 然后6孔板內(nèi)每孔加入2 mL冰甲醇固定30 min, 固定結(jié)束后使用PBS輕輕潤洗2次, 然后使用結(jié)晶紫染色5 min, 再用PBS輕輕潤洗后室溫干燥。

5.干燥完成后將6孔板移至顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞克隆斑數(shù)量, 超過50個(gè)細(xì)胞的克隆斑即可計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞克隆斑形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%來計(jì)算細(xì)胞體外克隆率。