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蒂科(上海)生物科技有限公司

細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作步驟和注意事項(xiàng)

時(shí)間:2021-12-9閱讀:7717

 原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后,需要進(jìn)行分離培養(yǎng),否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過大,營養(yǎng)障礙,影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株),可以進(jìn)行細(xì)胞克隆,易于保存,但可能喪失一些特殊的細(xì)胞和分化特征。傳代細(xì)胞形成細(xì)胞株的da利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)材料,便于實(shí)驗(yàn)。

1. 操作步驟

(1)吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

(2)向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。

(3)置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進(jìn)行消化,2~5min后把培養(yǎng)瓶放在 倒置顯微鏡 下進(jìn)行觀察,當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后,應(yīng)立即中止消化。

(4)吸出消化液,向瓶內(nèi)加入Hanks液少量,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,把殘留消化液沖掉,然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,終止消化。

(5)使用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞,使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔,以防用力過猛損傷細(xì)胞。

(6)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,分別接種于新的培養(yǎng)瓶中,置CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

(7) 細(xì)胞培養(yǎng) 換液時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來確定。一般2~3d后應(yīng)換一次生長液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面,即可使用;也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。

2. 注意事項(xiàng)

(1)掌握好細(xì)胞消化的時(shí)間,消化時(shí)間過短時(shí),細(xì)胞不宜從瓶壁脫落,過長的消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。

(2)掌握好消化濃度,當(dāng)消化液濃度過高時(shí),消化時(shí)間應(yīng)縮短,過低時(shí)細(xì)胞消化時(shí)間相對(duì)延長。

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