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上海嘉鵬
主營產(chǎn)品： 超微量分光光度計(jì),核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計(jì),nano光度計(jì),超微量核酸蛋白檢測儀 |
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2018-3-6 閱讀(4363)
核酸純化在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)廣泛應(yīng)用。怎樣獲得高質(zhì)量、高純度的DNA或RNA樣品對下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行至關(guān)重要，因此，對純化后的核酸進(jìn)行鑒定也是*的步驟。本文簡單的回顧學(xué)習(xí)一下核酸鑒定的方法。
核酸鑒定包括：濃度/純度鑒定+完整性鑒定
1.濃度/純度鑒定
（1）紫外分光光度計(jì)：
原理：由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質(zhì)。核酸在紫外光譜區(qū)有一條典型的吸收曲線，其吸收高峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的吸收高峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)是鑒定核酸的重要依據(jù)之一。
由于核苷酸zui大吸收波長為260nm,根據(jù)朗伯-比爾定律可計(jì)算出在波長260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于50µg/ml的雙鏈DNA， 40µg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測定濃度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
計(jì)算公式:
dsDNA（µg/µl）=OD260x50x稀釋倍數(shù)/1000
RNA（µg/µl）=OD260x40x稀釋倍數(shù)/1000
純凈的DNA OD260/OD280=1.8，制備的樣品DNA比值在1.7-1.9，若洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)镻H值和離子存在會(huì)影響光的吸收值。
當(dāng)OD260/OD280< 1.7，表明蛋白質(zhì)含量較高，可用利用酚、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
當(dāng)OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量較高?？捎肦NaseA消化后再進(jìn)行純化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、鹽類或有機(jī)試劑污染。
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