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transwell实验

transwell实验服务原理

Transwell实验利用带有微孔膜（通常为聚碳酸酯材质）的小室装置，分隔上下两层培养液，通过化学趋化因子（如血清、生长因子）诱导细胞迁移或侵袭：

• 迁移实验：细胞直接穿过孔径（通常5-8μm）到达下室，无需基质胶，反映基础迁移能力。

• 侵袭实验：需预先在膜上涂覆Matrigel基质胶（模拟细胞外基质），细胞需分泌蛋白酶（如MMPs）降解胶层后才能穿透，模拟体内侵袭过程。
  

实验步骤

1. 基质胶包被（仅侵袭实验）：

• 稀释Matrigel（常用1:8比例），取200μL加入上室，37℃孵育30分钟形成凝胶层。

• 部分实验直接使用未稀释胶（150μL），凝固时间延长至5小时。

2. 细胞准备与接种：

• 消化细胞并计数，调整密度（如5×10?个/孔），用无血清培养基重悬后接种至上室。

• 下室加入含趋化因子（如20-30% FBS）的培养基，形成浓度梯度诱导迁移。

3. 培养与固定：

• 孵育时间依细胞类型而定（通常24-48小时），随后取出小室，PBS清洗，甲醇固定细胞（10-30分钟）。

4. 染色与计数：

• 使用结晶紫（0.4%-0.5%）染色5-20分钟，棉签擦除未迁移细胞，显微镜下计数下室或膜底面的细胞数。

transwell实验服务应用领域

• 肿瘤研究：评估癌细胞的转移潜能（如检测E2F1、LKB1基因沉默对舌鳞癌、肺癌细胞侵袭的影响）。

• 药物筛选：测试化合物对细胞迁移/侵袭的抑制效果，如miR-325-3p通过靶向PBOV1抑制肝癌细胞转移。

• 免疫与发育生物学：研究白细胞趋化、干细胞定向迁移等。

注意事项

1. 避免气泡：接种时需轻柔，避免气泡阻隔细胞迁移路径。

2. 膜孔径选择：依细胞大小调整（8μm适用于肿瘤细胞，5μm用于较小细胞如白细胞）。

3. 血清梯度控制：下室需高浓度血清（≥20%），上室用无血清培养基，确保趋化效果。

4. 基质胶处理：稀释比例和凝固时间需优化，过厚可能阻碍细胞穿透。

5. 细胞状态：确保细胞活性＞90%，密度适中（过高易堆积，过低统计误差大）。

结果分析

• 定量方法：直接计数（显微镜）、结晶紫溶解后测OD值，或MTT法。

• 统计学处理：需重复≥3次，采用t检验或ANOVA分析组间差异（如P<0.05为显著）。

局限性及改进

• 传统方法可能受外泌体或间隙连接干扰，改进方案可排除此类因素（如肝素阻断外泌体摄?。?span>。