“雜音"染色種類繁多,產(chǎn)生的原因也多種多樣,為了便于說明,筆者將其歸納為下面幾種。
1、灶片狀著色
切片中著色區(qū)東一塊西一塊,呈灶片狀分布,出現(xiàn)這種問題的原因有:(1)裱片時水未排盡,在局部形成氣泡使組織突起,染色時試劑滲入后不易洗盡,顯色過深所致。解決辦法是,漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡,晾片熱臺不能平放,應(yīng)有45度左右的斜度,利于水流走和蒸發(fā)。(2)壞死組織灶,組織壞死后細胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解,復(fù)雜的肽鏈殘段(如Fc段)可能與一抗或/和二抗結(jié)合導致zui終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。(3)制作APES膠片時,膠的濃度太高,干燥后在玻片上留下白色小點,顯色時白色小點著色。解決辦法是按照標準的制備方法進行,即5%鹽酸酒精(5 ml鹽酸+95%酒精95 ml)浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片1小時、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥(室溫)、2% APES(2 ml APES+98 ml丙酮)浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮(1-2秒鐘)、玻片過一下蒸餾水(1-2秒鐘)、37 度干燥、室溫儲存?zhèn)溆?。如果制片過程中,因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時可適當加入一些丙酮。
2、細胞漿著色
胞漿著色是所有“雜音"染色中有欺騙性的著色,著色區(qū)局限在細胞內(nèi),間質(zhì)無著色,看上去與真實的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣,很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì),因此,很多非特異性的染色除了見于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色,可以通過血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色,如血紅蛋白(紅細胞)、肌紅蛋白(肌細胞)、細胞色素(粒細胞、單核細胞)、過氧化氫酶(肝、腎),這些可用過氧化氫進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色,這種著色不易避免,但可以通過形態(tài)學辨認出巨噬細胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色有欺騙性,因為它廣泛的存在于組織細胞中,我們研究結(jié)果顯示:冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素,經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉,加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露,內(nèi)源性生物素暴露的強度在不同的組織有所不同,從弱陽性(+)到強陽性(+++),內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式,既有散在分布也有彌漫分布,主要以顆粒狀形式存在于胞漿中,內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織,特別是腺上皮組織,亦存在部分非上皮組織,內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織,內(nèi)源性生物素暴露的強弱與修復(fù)液有關(guān),其強度增加依次為:檸檬酸、EDTA、EGTA,熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉,非生物素檢測系統(tǒng)Polymer兩步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干擾。
3、細胞核著色
不適當?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細胞核著色,如組織在二甲苯里浸泡時間太長(如從星期五浸泡到下星期一)、緩沖液中浸泡時間太長、組織變干、微波修復(fù)液的PH值和修復(fù)時間不當或修復(fù)過程中修復(fù)液留下得太少,未沒過組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規(guī)進行工作。
4、間質(zhì)著色
著色部位主要在間質(zhì),間質(zhì)著色的原因很多,如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團相互作用形成非特異性的連接而著色,加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì),很容易與抗體結(jié)合,造成間質(zhì)著色,特別是lambda和kappa染色時。當甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時,做甲狀腺球蛋白染色也會出現(xiàn)間質(zhì)著色??贵w不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色,我們曾遇到CD20抗體不純,除了染上B細胞外還染上了間質(zhì)。
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