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費(fèi)氏弧菌發(fā)光桿菌污染的檢測和判別

1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑
1.1 器材
高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、帶搖床的培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)皿、 接種針、平板涂布器、酒精燈、載玻片
1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液
1.3培養(yǎng)基
(1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：直接稱量營養(yǎng)瓊脂粉4.5g，溶于100mL蒸餾水配制，pH7.2，分裝到試管中， 滅菌后擺成斜面。
(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氫氨 0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉 0.5%、磷酸氫二鉀 0.1%
(3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基： 牛肉膏 0.3%、蛋白胨 0.8%、 葡萄糖 0.5%、 氯化鈉 0.5%、 0.4% 酚紅溶液，pH7.2
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1種子的擴(kuò)大培養(yǎng)
2.1.1斜面培養(yǎng)基的配制
配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分裝，滅菌（121℃條件下滅菌 30min），倒斜面。
2.1.2菌種的活化
⑴將費(fèi)氏弧菌發(fā)光桿菌采用無菌操作的方法接種于斜面上，37 ℃下培養(yǎng)18h；
⑵培養(yǎng) 18h 后，觀察菌落顏色是否一致，若均為黃色，挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進(jìn)行無菌檢測；若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進(jìn)行無菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢，若檢測后，沒有污染，便可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；若檢測到雜菌，要重復(fù)上述步驟，直到無菌為止，否則，不能繼續(xù)下一步操作。
2.1.3擴(kuò)大培養(yǎng)
在無菌條件下，從檢測后的活化培養(yǎng)基上挑取10個(gè)左右菌落，用接種針接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中，于 37℃ 下振蕩培16-18h，觀察菌落形態(tài)。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察，根據(jù)結(jié)果來判斷能否進(jìn)行下一步。
2.2污染的檢測和判別
2.2.1顯微鏡檢查
⑴取樣：用無菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上；
⑵制片、染色：自然風(fēng)干后,用番紅染液染色 1-2min，水洗；
⑶干燥后用油鏡下觀察。
2.2.2平板檢查
⑴配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，倒平板；
⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約 10–6～10–7) 后涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，在 37℃下培養(yǎng) 24h；
⑶觀察菌落形態(tài)。
2.2.3肉湯培養(yǎng)檢查法（用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*）
將1ml待測液（滅菌處理后的種子培養(yǎng)基）接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中，于 37℃下培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1種子的擴(kuò)大培養(yǎng)
觀察到在活化培養(yǎng)基上長出大量菌落，且菌落顏色單一，均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量，制作裝片，染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)多個(gè)視野中都為桿菌，可初步得出活化的菌種中沒有污染雜菌。挑取沒有污染雜菌的菌落，用無菌操作技術(shù)接種，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在適宜條件下培養(yǎng) 18h 后，得到了費(fèi)氏弧菌發(fā)光桿菌的種子液，吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌。
3.2 顯微鏡檢查
鏡檢時(shí)，多個(gè)視野中均觀察到的均為桿菌，呈鏈狀或單個(gè)存在，沒有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細(xì)菌，因此可初步認(rèn)為該種子液中沒有雜菌污染。
3.3 平板檢查
從營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，這是典型的大腸桿菌菌落，沒有觀察到其它形態(tài)的菌落，因此可初步認(rèn)為該種子液中沒有雜菌污染。
3.4 肉湯檢測培養(yǎng)基滅菌是否*
葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液，酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境中呈紅色。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測液若有菌體存在，則菌體代謝會(huì)使培養(yǎng)基呈酸性，顯示黃色。該肉湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后，仍呈現(xiàn)紅色，沒有變?yōu)辄S色，且澄清，未渾濁，說明待測液中沒有菌體存在，，因此，所測的滅菌種子培養(yǎng)基中沒有被菌體污染。
4實(shí)驗(yàn)討論
4.1 在種子的擴(kuò)大培養(yǎng)前要對(duì)菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子，若菌種已活化則可省略這一步。種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌，則應(yīng)棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來活化和擴(kuò)大培養(yǎng)。
4.2 采用顯微鏡檢查法，如果從視野中發(fā)現(xiàn)有與目標(biāo)菌株不同形態(tài)的菌體則可認(rèn)為是污染了雜菌，該法簡便、快速，能及時(shí)檢查出雜菌。但是也有其不足之處：①對(duì)含雜菌少的樣品不易得出正確的結(jié)論，故應(yīng)多檢查幾個(gè)視野；②由于菌體較小，本身又處于非同步狀態(tài)，應(yīng)注意不同生理狀態(tài)下目標(biāo)菌與雜菌的區(qū)別，必要時(shí)可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別；③對(duì)固形物多的發(fā)酵液檢查較困難。
4.3 采用平板檢查法，若出現(xiàn)與目標(biāo)菌株形態(tài)不一的菌落，就表明可能被雜菌污染；若要進(jìn)一步確證，可配合顯微鏡形態(tài)觀察，若個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標(biāo)菌相異，則可確認(rèn)污染了雜菌。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測，形象直觀，肉眼可辨，不需儀器。但需嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作技術(shù)，所需時(shí)間較長，而且無法區(qū)分形態(tài)與目標(biāo)菌相似的雜菌。在污染初期，目標(biāo)菌占絕大部分，污染菌數(shù)量很少，所以要做比較多的平行試驗(yàn)才能檢出污染菌。
4.4 肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來檢測培養(yǎng)基的滅菌是否*，不適用于發(fā)酵液的檢查。
4.5 可以用發(fā)酵參數(shù)判斷法來檢測是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過程中，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標(biāo)，作曲線，若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化，則很可能是污染了雜菌。但是，發(fā)酵參數(shù)判斷法很難檢查出早期的污染菌。
5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)我們了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害，知道染菌不僅浪費(fèi)大量原材料，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且污染了環(huán)境，所以，在種子活化培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中每一步均需進(jìn)行無雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來檢測雜菌污染，方法較為簡便、形象直觀，但是，若要進(jìn)行更準(zhǔn)確的檢測，再做較多的平行實(shí)驗(yàn)。肉湯培養(yǎng)檢查法是用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*的有效方法。

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