亮發(fā)光桿菌的冷凍干燥保藏操作說明
1.冷凍干燥管的選擇與清洗
冷凍干燥管一般采用耐溫度驟變，耐壓，管壁厚度均一并且為中性玻璃的安瓿管。管的內徑為8mm左右，長度不小于100mm：
清洗安瓿管時，先用2％鹽酸浸泡，然后用自來水沖洗3次以上，zui后用蒸餾水沖洗、浸泡至pH中性，然后干燥。
2.標簽的準備
菌種的標記方法有很多種，一般分為管外側標記和管內標記兩種。
管外側標記常用以下兩種方式：
(1)采用標簽機在大小為1cm×3cm左右的標簽上打印菌種編號、保藏日期，然后貼在安瓿管外。
(2)將膠布剪成大約1 cm寬，3～4cm長的小條，在上面填寫菌種編號、保藏日期，然后貼在安瓿管外：使用碳素鉛筆標記。
管內標記法：選擇濾紙或吸水紙(大小為1 cm×3cm)記錄菌種的編號、保藏日期，滅菌后裝入冷凍干燥后的安瓿管內。
3.保護劑的選擇和準備
保護劑可以減少冷凍干燥引起的微生物細胞的損傷。保護劑的選擇與配制因所保藏的菌種的不同有所變化。配制保護劑時，應注意保護劑材料的搭配、保護劑的濃度以及pH值(一般保持中性)。常用的保護劑為脫脂乳。一般微生物保存常用的保護劑參見附錄B《常用保護劑》。厭氧微生物冷凍干燥所用的保護劑在使用前應在100℃的沸水中煮沸15min左右，脫氣后放入冷水中急冷，以除掉保護劑中的溶解氧。
4.分裝與加棉塞
分裝菌液應在無菌條件下操作。采用較長的滴管，直接將菌液滴人安瓿管或凍存管底部．注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0．1～0．2ml。若是球形安瓿管，裝量為半個球部。一般2～2 5ml菌液可以分裝10～15個安瓿管。分裝后用脫脂棉堵住安瓿管管口，注意不要過緊或過松。分裝時間盡量要短，在1—2h內分裝完畢并預凍。
5.預凍
不同保護劑的共晶點溫度不同，預凍溫度應低于共晶點溫度10℃左右。
目前，常用降溫方法有以下3種：
(1)程序控溫降溫法。應用程序控制降溫儀，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率；
(2)冷凍干燥機自行冷凍。某些冷凍干燥機具有冷凍功能，在真空泵不開啟的情況下，可將菌種冷凍到一40℃左右；
(3)將菌種放入一80℃冰箱預凍：預凍速度控制在每分鐘下降1℃、使樣品凍結到一35～一40℃。
6.冷凍干燥
采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。
將預凍后的樣品安瓿管迅速置于已充分預冷的冷凍干燥機樣品艙內，關閉放氣閥，打開真空泵開始冷凍干燥，接近干燥完成時，適當升溫(按冷凍干燥機的具體要求進行操作)，確認冷凍干燥完畢后，緩慢打開放氣閥，取出樣品安瓿管置于干燥器內，備用。
判斷冷凍干燥已*的指標：
·安瓿管內凍干物呈酥松塊狀或松散片狀；
．冷凍干燥機顯示的樣品溫度與艙內溫度接近；
．蒸餾水對照管中的水分已*揮發(fā)掉或1％-2％氯化鈷的對照管已呈深藍色。
7.安瓿管封口及真空檢驗
從干燥器中取出冷凍干燥*的安瓿管，在距管口5cm左右用噴射火焰(噴燈、焊槍等)將安瓿管托細，然后將安瓿管口連接到與真空安瓿管泵相連的橡皮管上，打開真空泵，在真空條件下(一般真空度達到0.001托)，用噴射火焰對準安瓿管*部加熱熔封。
熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀檢測真空度。
8.保藏
封口*的冷凍干燥管應低溫避光保藏。
9.質量檢查
一般在封口后ld、7d、30d隨機抽取若干支冷凍干燥管進行各項指標檢查，例如，存活率、能力、形態(tài)變異、雜菌污染等?？蓞⒁妵易匀豢萍假Y源平臺制定的《微生物菌種純度檢測技術規(guī)程(試行)》。
10.冷凍干燥法適用范圍
適用于大多數(shù)細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、部分絲狀真菌和酵母等的保藏，但不適用于藻類和原蟲等的保藏。
11.保藏周期
不同微生物的保藏周期不同，一般在10年左右。
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