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青島捷世康生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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厭氧培養(yǎng)系列
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過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒說明書(紫外分光光度法)

時(shí)間:2021/9/29閱讀:3034
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注意:正式測定之前選擇2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

貨號(hào): JSK540

規(guī)格: 50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容:

提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 60mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 100μL×3 瓶,4℃保存。

產(chǎn)品說明:

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是最主要的 H2O2 清除酶,在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

H2O2  240nm 下有特征吸收峰,CAT 能夠分解 H2O2,使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降,根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出 CAT 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑:

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟:

一、粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量104 個(gè):提取液體積(ml 500-1000:1 的比例建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞功率 20% 200w,超聲 3 秒,間隔 10 秒。重復(fù) 30 );8000g 4℃離心 10 分鐘,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml)為 15-10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10 分鐘,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。二、CAT 測定操作

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 240nm 處,蒸餾水調(diào)零。

2、 CAT 檢測工作液的配置:用時(shí)在每瓶試劑二(100μL)中加入 20ml 試劑一,充分混勻,作為工作液;用不完的試劑 4℃保存一周。

3、 測定前將 CAT 檢測工作液 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其他物種)水浴 10min。

4 1mLCAT 檢測工作液于 1mL 石英比色皿中,再加入 35μL 樣本,混勻 5s;室溫下立即測定 240nm

下的初始吸光值 A1 1min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA=A1-A2

三、CAT 活性計(jì)算:

1、 血清(漿)CAT 活力的計(jì)算:

 

單位的定義:每毫升血清漿在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CATU/mL)=﹝ΔA×V 反總÷ε×d×109÷V ÷T=678×ΔA 2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算:

a. 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CATU/ mg prot)=﹝ΔA×V 反總÷ε×d×109÷V ×Cpr÷T=678×ΔA÷Cpr

b. 按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CATU/g 鮮重)=﹝ΔA×V 反總÷ε×d×109÷W×V ÷V 樣總)÷T=678×ΔA÷W 3、 按細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每分鐘反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CATU/104 cell)=﹝ΔA×V 反總÷ε×d×109÷500×V ÷V 樣總)÷T=1.356×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,1.035×10-3L;ε: H2O2 摩爾吸光系數(shù),4.36×104L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.035ml;V 樣總:加入提取液體積,1ml;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。W,樣本質(zhì)量,g;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/ml500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。


 

 

 

 



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