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青島捷世康生物科技有限公司
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磷脂酶 A2(phospholipase A2,PLA2)試劑盒說明書

時(shí)間:2020/12/21閱讀:1395
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分光光度法 50 管/24 樣

注意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

磷脂酶 A2(EC3.1.1.4)是磷脂 sn-2 位脂?;饷?,廣泛存在于動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中,參與脂肪消化,精子成熟、細(xì)胞信號(hào)傳遞、脂質(zhì)過氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過程,在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測(cè)定原理

磷脂酶 A2 作用于 2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿(HEPC)產(chǎn)生游離巰基,與DTNB 反應(yīng)生成黃色物質(zhì),在 412nm 處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、超速冷凍離心機(jī)、研缽、可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿。

試劑組成和配制

提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。試劑二:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。

試劑三:液體×5 瓶,-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入 4.5mL 試劑二充分混勻;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

樣品處理

1. 組織:按照質(zhì)量g:提取液體積(mL) 15~10 的比例建議稱取約 0.1g,加入 1mL提取液加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,10000g 離心 5min,取全部上清于 4℃、100000g離心 30min,棄上清,取沉淀溶于 1mL 試劑一。

2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量104 個(gè):提取液體積mL 500~1000:1  的比例(建議 500萬細(xì)胞加入 1mL 提取液,冰浴超聲波破碎細(xì)胞功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min;然后于 4℃,10000g 離心 5min,取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min,棄上清,取沉淀溶于 1mL 試劑一。

3. 血清:直接測(cè)定。

 測(cè)定操作 

 

對(duì)照管

測(cè)定管

樣品(μL

100

100

試劑二(μL

900

 

試劑三(μL

 

900

充分混勻,37℃反應(yīng) 10min,于 1mL 玻璃比色皿,蒸餾水調(diào)零,測(cè)412nm 處吸光值,記為 A 對(duì)照管和 A 測(cè)定管,△A=A 測(cè)定管- A

對(duì)照管

 

磷脂酶 A2(phospholipase A2,PLA2)試劑盒計(jì)算公式

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義每毫克蛋白每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/mg prot)= A÷( ×d)×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T

= 73.53×△ A÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義每克組織每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/g 鮮重)= △ A÷( ×d)×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T= 73.53×△ A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義104 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/104 cell)=  A÷( ×d)×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總)÷T= 73.53×△ A÷細(xì)胞數(shù)量

4 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義每毫升血清每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/mL)=  A÷( ×d)×V 反總÷V 樣÷T

= 73.53×△ A

:TNB 消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 反總:反應(yīng)總體積,1mL; V 樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.1mL;W:樣本質(zhì)量,g;V 樣總:加入提取液體積,1mL; T:反應(yīng)時(shí)間,10min

 

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