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溴化乙錠Taq 延伸 PCR 添加劑Tween2010% 溶液dNTP 溶液PCR 緩沖液熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶引物

無菌槍頭瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

溴化乙錠

Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagene)

Tween20，10% 溶液

2. 酶和酶緩沖液

dNTP 溶液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 25 mmol/L)

PCR 緩沖液，10X, 用戶買熱穩(wěn)定聚合酶時公司一并提供，或者 PCR 優(yōu)化緩沖液，比如，Opti-Prime PCR 優(yōu)化試劑盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)

熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)

3. 核酸和寡核苷酸

可選擇：插入物特異的引物（在雙向克隆中用來確定插入物的方向）

一套篩選重組體的引物

4. 設備

用于劃板和接菌的無菌槍頭

用槍頭代替牙簽，是因為牙簽可通過毛細作用帶走液體，因此會改變反應混合物的濃度。

5. 額外項目

瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑，包括溴化乙錠

二、方法

1. 根據(jù)反應數(shù)目或要做的 PCR 反應的管數(shù)，在冰上用一個離心管像調雞尾酒一樣準備

PCR「雞尾酒」式混合物，按如下順序依次加入各種成分。

H₂O 將終體積補充到 25ul

Taq 緩沖液，10X                                                          2.5ul

Tween20(體積分數(shù) 10% 溶液）                                   1.0ul

dNTP 混合物（每種 dNTP 為 25 mmol/L)                     0.2ul

重組體篩選引物套（100ng/ul)                                     1ul

Taq 延伸 PCR 添加劑（5U/ul)                                     0.25ul

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)                                              0.25ul

2. 在冰上，分裝"雞尾酒"式 PCR 混合物到每一個 PCR 試管中，每管移取 25ul。

3. 對照反應中，加入 1ul 的非重組 DNA。
可以選擇：對于用來確定插入方向的反應，向恰當?shù)姆磻苤屑尤氲谌齻€插入物特異的引物。

4. 對于重組篩選，用一個無菌槍頭刺挑一下轉化后長出的菌落，然后在相應的反應管中攪動菌落物質。在給每一個反應混合物接種后，迅速地移走槍頭，并在含有抗生素平板上輕涂以留菌種，以備后續(xù)分析。對于 PCR 介導的重組篩選，也可參考下面的疑難解答。

5. 輕輕混勻每個反應體系。

6. 用推薦的循環(huán)參數(shù)進行 PCR。

7. 用標準的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物。推薦用 10~15 g/L 瓊脂糖凝膠來優(yōu)化分辨500~6000bp 的 PCR 產物。通常，取 1~5ul PCR 產物經(jīng)溴化乙錠染色后分析?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的瞬間成像技術或計算機圖像軟件來獲取圖像。